Purα对PARP1基因表达调控作用及在DNA损伤修复中作用机制研究

发布时间：2017-11-24 17:15

  本文关键词：Purα对PARP1基因表达调控作用及在DNA损伤修复中作用机制研究

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【摘要】：目的:Purα是一种多功能蛋白质,在体内的多个环节上都发挥着重要的作用,特别在神经系统的发育过程中发挥着更为重要的作用。Purα蛋白质在对DNA损伤与修复中的作用是非常明显的。有研究也表明在由复制叉终止引起的DNA双链断裂(DNA double-strand breaks,DSBs)修复中,Purα蛋白对修复的DNA起着监督的作用,这有助于维持基因组的稳定性,在神经退行性病变的发生中有着重要的意义。Purα的表达有特异性,与神经元的发育和突触形成有密切的关系。PARP1是存在于真核细胞中催化聚ADP核糖化的核酶。它能识别极低水平的DNA损伤,激活相应的DNA损伤修复系统,修复受损的DNA;而在DNA损伤严重时,它能启动细胞凋亡程序,从而维持了细胞遗传物质的完整性。我们前期的实验结果已经证实,Purα蛋白与PARP1蛋白有相互结合作用。然而,Purα蛋白是否调控PARP1基因的表达,如何进行调控,正调控还是负调控,Purα蛋白的活性功能域究竟位于什么地方,目前仍然不是十分清楚。我们的实验目的是通过研究过表达Purα蛋白对PARP1基因表达的影响来确定Purα蛋白对PARP1基因表达的调控作用。同时,通过研究Purα缺失突变体对PARP1基因的作用效果来确定Purα蛋白的活性结构域。此外,我们也通过研究Purα缺失突变体对APP基因的作用效果进一步来确定Purα蛋白在转录调控作用中的活性结构域。方法(1)根据基因序列设计引物,通过PCR扩增Purα基因的不同的缺失片段,构建与GFP融合表达的Purα缺失突变体(p EGFP-P1、p EGFP-P2、p EGFP-P3和p EGFP-P4)质粒。(2)通过Pull down Assay和Co-IP,进一步检测Purα和PARP1的Physical interaction,即两种蛋白之间是否存在实质性的结合。(3)在HT22细胞中,通过Luciferase Assay,Real time PCR和Western blotting assay分别在启动子、转录和翻译水平研究Purα蛋白及其结构突变体对PARP1基因的调控作用。(4)用2m M的羟基脲(hydroxyurea,HU)建立HT22细胞DNA损伤模型,通过免疫荧光技术观察两种蛋白在DNA损伤的细胞内的分布。同时,通过Western blotting assay研究过表达的Purα对PARP1蛋白的影响。(5)在HT22细胞中,通过研究过表达的Purα蛋白对m TOR通路中的信号分子的影响来探讨Purα对PARP1蛋白的作用机制。结果(1)经双酶切鉴定和质粒序列分析结果证明p EGFP-Purα缺失突变体质粒构建成功。(2)Pull down assay和Co-IP实验结果发现Purα蛋白和PARP1蛋白存在相互结合作用。(3)Luciferase Assay、Real time PCR和Western blotting assay结果证实全长Purα对PARP1基因有明显的正向调控作用,四个突变体中P3对PARP1和APP的调控作用最为显著。(4)DNA损伤模型下,Purα蛋白和PARP1蛋白存在共区域化的现象。同时,Western blotting assay表明Purα蛋白可以促进PARP1发挥其生物学功能,两种蛋白对DNA损伤的修复有协同作用。(5)Western blotting assay发现Purα蛋白是通过m TOR通路来调控PARP1基因的表达。结论(1)Purα蛋白和PARP1蛋白之间有直接的结合作用(Physical interaction)。(2)Purα蛋白可以正向调控PARP1基因的表达。(3)N端富含甘氨酸区是Purα活性中心。(4)在DNA损伤后,Purα蛋白和PARP1蛋白会聚集到细胞核中相互协作完成对损伤的修复。并且,在此过程中Purα蛋白可以促进PARP1发挥其生物学功能。(5)Purα蛋白是通过m TOR通路来调控PARP1基因的表达。
【学位授予单位】：宁夏医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 马琳;周瑜;李永玲;柴娟;贾中发;郭克;孙涛;崔建奇;;Egr-1对APP基因表达的调控作用[J];中国细胞生物学学报;2015年01期

2 ;Increased Levels of p53 and PARP-1 in EL-4 Cells Probably Related with the Immune Adaptive Response Induced by Low Dose Ionizing Radiation in vitro[J];Biomedical and Environmental Sciences;2010年06期

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本文编号：1222997