猪Sox6的基因克

发布时间：2017-11-25 16:16

  本文关键词：猪Sox6的基因克隆、原核表达及其在调控肌纤维类型转化中的作用

  更多相关文章： 猪 Sox6 基因克隆 原核表达 骨骼肌卫星细胞 肌纤维类型转化

【摘要】：由于传统的饮食习惯,猪肉成为世界消费量最大的肉产品。随着国家经济的发展,人们的生活水平越来越高,消费者对猪肉品质的要求也越来越高。而猪肉品质与肌纤维类型密切相关。根据肌球蛋白(MyHC)亚型,肌纤维可分为Ⅰ、Ⅱa、Ⅱx和Ⅱb型,分别以表达MyHC Ⅰ、MyHC Ⅱa MyHC Ⅱx和MyHC Ⅱb为主。提高Ⅰ型肌纤维在肌肉中的比例可有效地改善猪肉品质。Sox6是转录因子Sox基因家族的重要成员,参与肌纤维类型转化的调节,影响肌肉中Ⅰ型肌纤维的比例。因此,Sox6在猪肉品质调控方面有潜在的应用。但有关猪Sox6的研究目前在国内外尚未见报道。本研究旨在克隆猪Sox6基因,构建猪Sox6原核和真核表达载体,制备重组猪Sox6蛋白,考察过表达猪Sox6和外源添加重组猪Sox6蛋白对肌纤维类型转化的影响。主要研究内容及结果如下：试验一猪Sox6基因编码区全序列克隆及组织表达规律分析Sox6属于转录因子Sox基因家族的一员,参与肌纤维类型转化的调节,是慢肌特异基因的抑制子,影响肌肉中Ⅰ型肌纤维的含量。但猪Sox6基因序列目前尚不清楚。为此,本研究以3日龄DLY (DurocxLandracexYorkshire)仔猪为试验材料,取500mmg背最长肌用于总RNA提取并反转录成cDNA。根据已知的小鼠、大鼠和人的Sox6编码区序列,设计一对简并引物用于扩增猪Sox6基因目的片段。DNA测序结果显示,猪Sox6基因编码区全序列大小为2406bp,编码801个氨基酸。将该序列提交至GenBank,获得的序列登录号为KF933861。序列分析结果表明,猪Sox6基因核苷酸序列与已知的人、小鼠、大鼠和牛的Sox6基因核苷酸序列同源性分别为87.7%、86.71%、90.91%、89.49%。序列分析结果同时表明,猪Sox6蛋白的氨基酸序列与已知的人、小鼠、大鼠和牛的Sox6蛋白的氨基酸序列同源性分别为89.9%、90.74%、95.26%、90.53%,含有Sox6蛋白保守(100%同源)的HMG box、N端和C端的Q-box、亮氨酸拉链结构,暗示猪Sox6可能具有与已报道的其他物种Sox6相类似的功能。接下来,以10周龄DLY猪(母)为研究对象,采用实时荧光定量PCR检测猪Sox6基因在心、肝、肾、脂肪、背最长肌、趾长伸肌、比目鱼肌、腰大肌、胫骨前肌组织中的表达水平。结果表明,猪Sox6 mRNA在猪心脏和骨骼肌中表达最丰富,在肾脏、脂肪、肝脏、脾脏和肺组织中也可检测到,且在不同类型骨骼肌组织中存在表达差异(背最长肌趾长伸肌比目鱼肌)试验二猪Sox6基因在大肠杆菌中的表达和纯化以pET-30a(+)为载体,成功构建了用于表达C端融合6 X His-Tag的重组猪Sox6的原核表达载体pET-30a(+)-pSox6。以大肠杆菌Rosetta (DE3)为宿主菌,实现了猪Sox6基因的表达,目的蛋白分子量约为90 kDa。为获得最佳蛋白表达条件,分别设置了0mmol/L、0.25 mmol/L、0.5mmol/L、0.75 mmol/L、1.0 mmol/L、2.0 mmol/L、3.0 mmol/LIPTG诱导浓度和分别设置了1h、3h、4h、5h、6h、8h表达时间点,SDS-PAGE结果表明,重组蛋白最佳表达条件为在30℃下用1mM IPTG诱导表达5h。溶解性分析结果表明,重组蛋白以可溶性方式存在。表达产物采用亲和层析法进行纯化,最终重组蛋白浓度约为5μg/mL。对纯化后的重组蛋白进行Western blot和蛋白质串联质谱(MALDI-TOF/TOF)鉴定,结果表明,纯化的重组蛋白为猪Sox6蛋白。试验三猪Sox6在调控肌纤维类型转化中的作用在成功构建重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-pSox6、获得重组猪Sox6蛋白和分离原代猪骨骼肌卫星细胞的基础上,本研究考察了猪Sox6对肌纤维类型转化的影响。首先,采用肌肉注射方法将pcDNA3.1(+)-pSox6质粒注射到小鼠胫骨前肌中,在动物水平探讨过表达猪Sox6对MyHC各亚型表达的影响。实时荧光定量PCR结果表明,过表达猪Sox6显著下调了MyHC Ⅰ mRNA的表达,同时显著上调了 MyHC Ⅱa、MyHC Ⅱx和MyHC Ⅱb mRNA的表达。Western Blot结果表明,过表达猪Sox6下调了MyHC Ⅰ蛋白的表达,同时上调了MyHC Ⅱb蛋白的表达。其次,以C2C12细胞为对象,从体外水平探讨了过表达猪Sox6对MyHC Ⅰ和MyHC Ⅱb蛋白表达的影响,结果表明,过表达猪Sox6下调了C2C12细胞中MyHC Ⅰ蛋白的表达,同时上调了C2C12细胞中MyHC Ⅱb蛋白的表达。最后,在体外水平探讨了外源添加重组猪Sox6蛋白对原代猪骨骼肌卫星细胞中慢肌纤维相关基因表达的影响,结果表明,外源添加重组猪Sox6蛋白显著下调了猪骨骼肌卫星细胞中MyHC I、Tnnt1、Tnnc1、Tnni1 mRNA的表达。上述结果表明,猪Sox6在调控肌纤维类型转化中发挥了重要的作用。总之,本研究成功克隆了猪Sox6基因编码区全序列并发现其主要表达于猪心脏和骨骼肌中,首次用大肠杆菌表达系统、亲和层析纯化以及稀释复性的方法获得了具有生物学活性的重组猪Sox6蛋白,证实了猪Sox6在调控肌纤维类型转化中发挥了重要的作用。本研究结果填补了猪Sox6基因的空白,同时为改善猪肉品质提供了重要理论依据和新的思路。
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S828

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本文编号：1226636