基于异戊烯基转移酶基因SNPs的高甘草酸含量分子标记研究

发布时间：2017-12-17 00:06

  本文关键词：基于异戊烯基转移酶基因SNPs的高甘草酸含量分子标记研究

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【摘要】：甘草作为我国最为常用的大宗药材和重要添加剂,可以药食兼用,被誉为“国老”,其根及根茎中的三萜类成分甘草酸是甘草药材的最主要活性成分。但是由于野生甘草资源日趋匮乏,占据主流市场的栽培甘草中药效成分甘草酸含量普遍偏低,难以达到《中国药典》标准,并且个体差异明显,这些严重制约了甘草的临床使用和制剂生产。因此,研究栽培甘草品质下降的原因以及如何提高栽培甘草的药材品质使其最大程度接近野生道地甘草是亟待解决的关键问题。本课题组前期研究发现甘草酸生合成途径上HMGR、SQS、β-AS的功能基因多态性能够解释部分甘草酸含量的遗传变异机制,又通过大量文献查阅发现植物中次生代谢产物的生合成途径共同构成一个相互联系相互影响的代谢网络。因此本论文以与甘草酸合成途径有相交节点的重要植物激素细胞分裂素合成途径出发,结合HPLC技术和ELISA技术检测外源细胞分裂素处理后甘草酸含量变化以及甘草中的甘草酸含量和细胞分裂素含量,并运用统计学软件分析甘草酸与细胞分裂素的相关性；同时克隆出甘草中细胞分裂素合成的关键酶IPT基因全长序列,并采用PCR-测序技术获得甘草IPT基因中可能存在的SNPs。最后分析甘草IPT基因SNPs与甘草酸含量之间的关联,尝试寻找基于IPT基因SNPs的高甘草酸含量分子标记,为揭示甘草酸遗传变异的分子机制,提高栽培甘草的甘草酸含量和选育优良种质提供重要依据。本研究的主要结果如下：(1)分析外源细胞分裂素(6-BA)处理甘草后的甘草酸含量。采用叶片喷施方法对甘草植株进行外源细胞分裂素(6-BA)处理,利用HPLC技术检测体内甘草酸含量的动态变化。实验结果表明绝大多数6-BA处理的甘草植株中甘草酸含量在各自取样时期都较对照有明显升高(P0.05),其中6月份100mg-L-1的6-BA处理的效果最为显著,其5次取样较对照的提高幅度分别为：38.02%、72.31%、7.52%、59.34%、43.30%。6月份15mg-L-1和7月份25mg·L-1、100mg·L-1的6-BA处理亦能明显促进甘草酸的积累。(2)分析甘草中甘草酸含量和细胞分裂素含量。利用HPLC技术和ELISA技术检测98份相同生长环境和年限的甘草中甘草酸含量和细胞分裂素(玉米素核苷、二氢玉米素核苷、异戊烯基腺苷)含量,研究结果发现单株之间甘草酸含量差异明显,变异范围为0.61%～3.87%；甘草中主要细胞分裂素含量在取样时期差别不大,总体水平偏低。统计学分析表明甘草中甘草酸含量与细胞分裂素含量存在明显的正相关关系,与外源细胞分裂素处理能够提高甘草酸含量的结果相佐。(3)获得了甘草IPT基因全长序列信息。全长为1002bp,仅有1个外显子,不存在内含子,编码一个由333个氨基酸组成的蛋白。(4)运用PCR-测序技术筛选甘草IPT基因SNPs。通过对上述98份甘草样品进行检测,发现有161bp G/A、217bp G/A、348bp T/A、821bp A/G和848bp T/A共5处SNPs,其中348bp发生错义突变,其余为同义突变；根据5个SNPs位点,将供试样品划分为4种基因型G1:G-G-T-A-T、G2:G-G-A-A-T、G3:A-A-A-G-A、G4:G/A-G/A-T/A-A/G-T/A,前3者为纯合型,G4为杂合型。(5)分析甘草IPT基因SNPs与高甘草酸含量之间的关联。4种IPT基因型之间的甘草酸含量具有明显差异(P0.05)；5个SNPs位点中348bp为主要关联的SNP位点,821bp和848bp为辅助的关联SNP位点,细胞分裂素和甘草酸含量可能是一个或几个SNP综合作用的结果。将甘草IPT基因SNPs与甘草酸含量和细胞分裂素含量相结合,初步判断甘草酸的含量为348bpTA,821bpAG,848bpTA,杂交情况可能处于两种碱基之间,从而可以确立甘草IPT基因SNPs为高甘草酸含量的一个分子标记。
【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S567.71

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本文编号：1297972