腺病毒介导的CSFV E0基因在奶山羊乳腺中的表达
本文关键词：腺病毒介导的CSFV E0基因在奶山羊乳腺中的表达 出处：《西北农林科技大学》2015年硕士论文 论文类型：学位论文
【摘要】：猪瘟(CSF)是由猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus,CSFV)引发的一种烈性传染病,给我国以及全世界的养猪业都带来了巨大的危害。目前,除了一些已经消灭猪瘟的国家和地区,防治猪瘟的主要方法仍以接种猪瘟的减毒活疫苗为主。但猪瘟在世界范围内的流行形式已经发生改变,以往的兔化减毒活疫苗已经不能完全适应新形式下人们对猪瘟防控的新要求。此外,随着基因工程新型疫苗技术以及外源表达重组蛋白技术的发展,探索针对猪瘟的更加安全有效的新型疫苗已经是不可回避的趋势。因此,本研究构建了含有CSFV E0基因的重组腺病毒Ad-hisE0,并验证了其在牛乳腺上皮细胞和奶山羊乳腺中的表达,为研制猪瘟病毒基因工程亚单位疫苗和乳腺生物反应器奠定了基础。1.含有CSFV E0基因的重组腺病毒Ad-hisE0的构建以pMD-18T载体为模板,采用PCR技术克隆一段上游带有信号肽和His标签序列的CSFV E0基因,构建了腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV-hisE0。接着将其与腺病毒骨架载体pAd Easy-1重组,获得腺病毒重组质粒pAd-hisE0。将此重组质粒转染293A细胞包装得到重组腺病毒Ad-hisE0,对获得的重组腺病毒进行进一步扩增,纯化和滴度测定,获得了高滴度的重组腺病毒。2.重组腺病毒Ad-hisE0有效性的鉴定用获得的重组腺病毒Ad-hisE0感染HEK 293A细胞,绿色荧光蛋白的表达指示了腺病毒可以成功侵染细胞。感染48 h后,提取293A细胞的总RNA进行反转录,实时定量PCR检测CSFV E0基因mRNA水平的表达,结果显示E0基因在293A细胞内正常表达。说明获得的重组腺病毒可以侵染细胞,并可以介导E0基因在细胞内的有效表达。3.重组腺病毒Ad-hisE0在牛乳腺上皮细胞中的表达用重组腺病毒Ad-hisE0体外感染牛的乳腺上皮细胞,然后收集细胞及其上清,提取蛋白进行CSFV E0重组蛋白的Western blot分析,结果显示出分别位于26 kD和48 kD处两条特异性条带,与预期结果基本相符。表明该重组腺病毒具有侵染哺乳动物乳腺上皮细胞的能力,并且能够成功介导细胞表达和分泌E0蛋白。4.重组腺病毒Ad-hisE0在奶山羊乳腺中的表达用重组腺病毒Ad-hisE0通过乳腺导管灌注法体内感染泌乳期山羊的乳腺,于48 h后收集山羊的乳汁,将乳汁样品经过处理后用于Western blot分析,结果同样显示了两条特异性条带,分别处于26 kD处和48 kD处。证实构建的重组腺病毒Ad-hisE0可以介导重组融合蛋白CSFV E0在山羊乳腺中的表达和分泌。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65
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，本文编号：1335197
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