山新杨转Bt+蜘蛛杀虫肽基因的研究

发布时间：2016-10-15 17:08

本文关键词：转基因杨树的研究及其生物安全评价，，由笔耕文化传播整理发布。

《东北林业大学》 2009年

山新杨转Bt+蜘蛛杀虫肽基因的研究

左丽丽

【摘要】： 杨树作为用材、防风、绿化的主要树种,在我国各省、区具有广泛分布和大面积栽培。由于杨树的病虫害种类多、危害重,常常给我国的林业生产和生态建设造成巨大的经济损失。当前人类的生态和环境安全意识日益提高,大量使用化学农药防治病虫害将受到限制,生物防治的措施又比较薄弱,杨树有害生物可持续控制将是森林保护领域面临的问题。本研究以山新杨为受体,采用农杆菌介导法将Bt+蜘蛛杀虫肽抗虫基因导入该受体中,不仅为山新杨的遗传转化及抗性育种提供了理论基础,同时为山新杨抗虫品种(系)的扩繁和野外栽培提供了繁殖材料。 1.通过测定不同浓度头孢对山新杨叶片愈伤组织形成及分化的影响,认为山新杨叶片对头孢噻肟钠具有一定的抗性,筛选培养中加入浓度为600mg/L的头孢霉素不会对山新杨叶片愈伤形成和分化产生不利影响。 2.卡那霉素对山新杨叶片分化和诱导生根所能忍受的临界浓度为10mg/L,高于该浓度即可抑制山新杨叶片的分化;卡那霉素对山新杨诱导生根所能忍受的临界浓度为15mg/L,浓度达20mg/L以上时,组培苗的生长明显受到抑制。 3.在进行山新杨遗传转化时,预培养时间以2～3d为最好,2d的抗性芽率为23.3%,3d的抗性芽率为20%。预培养时间低于2d和大于4d抗性芽率下降。 4.菌液浓度过高会使受体材料迅速褐化死亡,菌液浓度过低转化抗性芽率低或为零,适宜于山新杨转化的菌液浓度为OD_(600)=0.1～0.2。侵染时间在2～5min有利于山新杨叶片的遗传转化。在菌液浓度一定时,侵染2～5min抗性芽率随时间的增加而提高。侵染5min以上时,虽叶片的分化率较高,但是形成的抗性芽较低。 5.共培养时间以2～3d为宜,4d以上不仅假阳性芽增加,而且外植体生长变弱、叶片和芽黄化。 6.优化了山新杨遗传转化系统,预培养2～3d、OD_(600)=0.1～0.2菌液侵染2～5min、共培养2～3d和共培养培养基中添加200μmol/LAS为山新杨遗传转化的最佳组合。 7.共侵染山新杨叶盘1570个,获得抗性芽植株86个,经PCR检测共获得21株转基因阳性植株,PCR检测阳性率达24.42%。PCR-Southern检测表明有21株显示出杂交信号,阳性率为100%,转化率为1.34%。

【关键词】：
【学位授予单位】：东北林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：S792.11
【目录】：

摘要3-4

Abstract4-8

1 绪论8-19

1.1 课题背景(或引言)8

1.2 杨树转基因研究概况8-17

1.2.1 杨树转抗虫基因研究进展9-15

1.2.2 杨树基因工程遗传转化技术15-17

1.3 山新杨概况17

1.4 研究目的和意义17-19

2 材料与方法19-37

2.1 材料19-21

2.1.1 植物材料与植物培养基19

2.1.2 菌株与质粒19-20

2.1.3 主要仪器和设备20

2.1.4 主要试验药品20

2.1.5 抗生素20-21

2.1.6 常用溶液的配制方法21

2.2 试验方法21-35

2.2.1 主要的技术路线21-22

2.2.2 山新杨组培苗的继代培养22-23

2.2.3 抗生素敏感性测定23-24

2.2.4 农杆菌介导抗虫基因转化24-26

2.2.5 影响农杆菌转化效率的因素26-27

2.2.6 转基因山新杨的PCR检测及PCR-Southern鉴定27-30

2.2.7 转基因植株的PCR-Southern检测30-35

2.3 本章小结35-37

3 结果与分析37-47

3.1 抗生素敏感性测定37-39

3.1.1 卡那霉素浓度对山新杨叶片分化的影响37

3.1.2 头孢噻肟钠浓度与山新杨叶片分化的关系37-38

3.1.3 卡那霉素浓度与山新杨茎段生根的关系38

3.1.4 头孢噻肟钠浓度与农杆菌生长的关系38-39

3.2 农杆菌转化效率与各因素的关系39-42

3.2.1 预培养时间对转化效率的关系39-40

3.2.2 最佳菌液浓度测定40

3.2.3 侵染时间测定40-41

3.2.4 共培养时间与转化效率的关系41-42

3.2.5 乙酰丁香酮(AS)对转化效率的影响42

3.3 转基因山新杨分子检测42-45

3.3.1 山新杨DNA提取42

3.3.2 转基因植株的PCR检测42-43

3.3.3 PCR-Southern检测43-45

3.4 本章小结45-47

结论与讨论47-49

参考文献49-54

附录54-58

攻读学位期间发表的学术论文58-59

致谢59-60

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【引证文献】

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