小斑马鱼多少钱_斑马鱼基因工程的研究进展

发布时间：2016-10-16 16:08

  本文关键词：斑马鱼基因工程的研究进展，由笔耕文化传播整理发布。

　遗传学报　ActaGeneticaSinica,October2004,31(10):1167～1174ISSN0379-4172

TheResearchProgressofZebrafishGeneEngineering

WUYu-Ping,XIONGQian,ZHANGGuang-Xian,XUAn-Long

(TheOpenLaboratoryofMarineFunctionalGenomicsofStateHigh-TechDevelopment,

CollegeofLifeSciences,SunYat-senUniversity,Guangzhou510275,China)

Abstract:Theresearchprogressofzebrafishgeneengineeringisreviewed,inincludingtherecentexplosionstatusoftransgeniczebrafishlines,transgeneiczebrafishintargetedscreens,thedevelopmentoftransgenictechnologyinze-brafishaswellasthecurrenthotspotsandfutureperspectiveofzebrafishgeneengineering.Bynowthezebrafishgeneengineering,nucleartransplantationandchromosomesetmanipulationtechnologieshavebeenestablishedinChina.Withfirmfoundationofzebrafishcytogeneticsandembryology,wewillobtaingeneengineeringzebrafishwithgenetar-getingintegrationandpromotetheadvancementanddevelopmentofbiotechnologyinappliedresearchfieldinnearfu-ture.

Keywords:zebrafish;geneengineering

斑马鱼基因工程的研究进展

吴玉萍,熊　茜,张广献,徐安龙

(中山大学生命科学学院,国家“863”计划海洋生物功能基因组开放实验室,广州　510275)

摘　要:对国内外斑马鱼基因工程研究进展,包括最近获得的大批转基因斑马鱼品系、靶向筛选的转基因斑马鱼、斑马鱼转基因技术的发展和斑马鱼基因工程的热点问题与应用前景进行了综述。指出我国已建立日趋成熟的斑马鱼转基因技术、细胞核移植技术和染色体组操作技术,具有斑马鱼细胞遗传学和胚胎学基础,我国有望在不久的将来获得定向整合的基因工程斑马鱼,并推动生物技术应用研究领域的进步和发展。关键词:斑马鱼;基因工程

中图分类号:Q341　　　文献标识码:A　　　文章编号:0379-4172(2004)10-1167-08

　　20世纪90年代开始启动的“人类基因组计划”(HGP)重点内容之一是对模式生物的研究。具备脊椎动物分子发育生物学和人类基因组计划模式种条件的斑马鱼,由于其易于进行细胞谱系分析并兼具酵母、线虫、果蝇和小鼠式遗传的特征而日益受到学者的关注。1981年,Streisinger[1]在《Nature》上发

表了关于斑马鱼克隆系的研究,随后它的基因连锁图的构建成为突变基因克隆的开端[2]。

1　斑马鱼基因工程研究概况

斑马鱼的转基因研究始于1988年[3,4],此后进

收稿日期:2003-10-17;修回日期:2004-02-13

基金项目:国家“863”计划项目(编号:2002AA629010)、国家自然科学基金(编号:30371113)、广东省科技计划项目(编号:2003C20303)和珠海

市科技计划项目(编号:PC200310043)资助[SupportedbytheNational“863”Project(No.2002AA629010),ChineseNationalNaturalScienceFoundation(No.30371113),theScienceandTechnologyProjectofGuangdongProvince(No.2003C20303)andtheScienceandTechnologyProjectofZhuhaiCity(No.PC200310043)]

作者简介:吴玉萍(1963-),女,博士,副教授,研究方向:鱼类遗传学。E-mail:exwyp@zsu.edu.cn

1168遗传学报　ActaGeneticaSinica　Vol.31　No.10　2004

展迅速。目前,国内外已获得大批转基因斑马鱼品系(表1)。例如:1992年,Lin等[5]把有色斑马鱼囊胚细胞注入白化种囊胚,得到有色素细胞的嵌合体,嵌合体与白化鱼交配得到有色后代;移植转lacZ基

因囊胚细胞也得到嵌合体,转基因性状可以传递给后代。斑马鱼转基因技术对分析体内细胞间相互作

用,作为动物模型探讨发育、生长、繁殖等机理,以及阐明控制脊椎动物的发育机制等方面均具有重要意义。目前,斑马鱼卵母细胞体外成熟、配子发生和受精的调控机制、胚胎干细胞的分离、基因克隆及基因敲除等研究都已成为研究热点。

表1　转基因斑马鱼品系

Table1　Transgeniczebrafishlines

表达分类Expressioncategory1无限制Unrestricted

pUSVCATRSV/lacZCMV/luciferasedHSP/CAT-NPT-BGALdHSP/HPTXenopusef1a/lacZ

PPPPP

pSV/hygro

转植基因Transgene

载体VectorP

表达模式Expressionpattern无表达Notexpressed一批阳性

Batchassaypositive无表达

Notexpressed无表达Notexpressed无表达Notexpressed

5个种系自普遍存在至斑驳的表达

Fivelinesrangefromubiquitoustopatch

MoMLV/lacZRSV/neoXenopusef1a/GFP

RP

无表达Notexpressed2/4可检测表达,普遍存在2/4withdetectableexpression,ubiquitous

Carpβactin/CAT

P

不均一表达,限制于轴向和轴旁的中胚层

Nonuniformexpressionlimitedtoaxialandparaxialmesoderm

Xenopusef1a/lacZZebrafishβactin/GFPXenopusef1a/GFPCarpβactin/CATCarpβactin/CATXenopusef1a/GFPntdMedakaβactin/GFPZebrafishef1a/H2BGFP

RPTPP+IPP+ITRP

无表达Notexpressed普遍存在Ubiquitous普遍存在Ubiquitous普遍存在Ubiquitous普遍存在Ubiquitous普遍存在Ubiquitous普遍存在Ubiquitous普遍存在(定位细胞核)Ubiquitous(nuclearlocaliza-tion)

2神经系统Nervoussystem

Zebrafishislet1/GFPZebrafishHuC/GFP

PP

MouseHSP/lacZ

P

7/8非表达系,1个种系表达7/8nonexpressinglines;1lineexpressing头盖运动神经元Cranialmotorneurons神经系统Nervoussystem

32＊6

[20]

88241219100

＊

转基因发生率(%)

Rateoftransgenesis

5＊7163316

参考文献Reference[3][4][6][7][8][9]

167

[10][11]

7

[12]

83

[13][14][15][16][16][17][18][19]

[21][22]

WUYu-Pingetal.:TheResearchProgressofZebrafishGeneEngineering1169续表1

表达分类Expressioncategory

转植基因Transgene

Goldfisha1tubulin/GFPZebrafishrodopsin/GFPRatGAP43/GFPZebrafishHuC/GFPZebrafishpax2.1/lacZ

载体VectorPPPPP

表达模式Expressionpattern神经系统Nervoussystem视网膜杆状体光感受器Rodphotoreceptors神经系统Nervoussystem神经系统

Nervoussystem

MHB,后脑,脊髓等

MHB,hindbrain,spinalcordetal.

转基因发生率(%)

Rateoftransgenesis2～54＊31009

参考文献Reference[23][24][25][19][26]

ZebrafishAANAT-2/GFP

3淋巴细胞Lymphoidcell

Zebrafishrag1/GFP

PPAC

松果腺光感受器Pinealphotoreceptor

容量最大载体,在胸腺肾、嗅觉神经元中表达

Largestconstructexpressedinthymus,kidneyandolfactoryneurons

3n.a.

[27][28]

4上皮细胞Epithelia5胰腺Pancreas6肌肉Muscle

Zebrafishkrt8/GFPZebrafishinsulin/GFPZebrafisha-actin/GFPZebrafisha-actin/GFP

PPP+ITRPP+/-NLS

上皮细胞Epithelia胰腺Pancreas肌肉Muscle

肌肉Muscle

中间细胞和循环血液Intermediatecellmassandcir-culatingblood

16n.a.6281

[29][30][18][14][31]

7血液Blood8生殖细胞Germcells9脉管系统Vasculature

Zebrafishgata1/GFP

Zebrafishvasa/GFPZebrafishfli1/GFP

PP

生殖细胞Germcells

脉管系统、主动脉弓、颌、鳍间叶细胞

Developingvasculature,aorticarches,jaw,finmesenchyme

215

[32][33]

10热激-诱导型Heatshock-inducible

Zebrafishhsp70/GFPZebrafishhsp/slit2-GFP

PP

热激普遍存在

Ubiquitousuponheatshock热激普遍存在

Ubiquitousuponheatshock

24

[34][35]

　　P:质粒;P+I:具绝缘子的质粒;P+NLS:质粒和核定位序列多肽;T:转座子;R:逆转录病毒;P+ITR:具反向末端重复的腺相关病毒的质粒;PAC:P1人工染色体;＊:基于单个转基因动物;n.a.:信息无效;lacZ:β-半乳糖苷酶基因;CMV:巨细胞病毒;CAT:氯霉素乙酰转移酶;HSP:热激启动子;GFP:绿色荧光蛋白;NPT:新霉素磷酸转移酶;BGAL:β-半乳糖苷酶;HPT:潮霉素磷酸转移酶;MoMLV:莫洛尼氏刚果红白血病毒。

P:plasmid;P+I:plasmidwithinsulatorelements;P+NLS:plasmid+nuclearlocalizationsequencepeptides;T:transposon;R:retrovirus;P+ITR:plasmidwithadeno-assoicatedvirusinvertedterminalrepeat;PAC:P1artificialchromosome;＊:basedonsingletransgenicanimal;n.a.:infor-mationnotavailable;lacZ:β-galactosidasegene;CMV:cytomegalovirus;CAT:chloramphenicolacetyltransferase;HSP:heatshockpromoter;GFP:greenfluorescentprotein;NPT:neomycinphosphotransferase;BGAL:β-galacosidase;HPT:hygromycinphospho-transferase;MoMLV:MoloneyMurineLeukemiaVirus.

　　1982年,Palmiter[36]等将大鼠生长激素基因转,“鼠”,这一突破性成果为动物基因工程定向育种研究,

1170遗传学报　ActaGeneticaSinica　Vol.31　No.10　2004

生物研究所朱作言领导的实验室在世界上率先开展了鱼类基因工程定向育种研究,建立了完整的转基因鱼理论模型和完善的实验技术体系,为转基因鱼育种奠定了理论基础。目前,全世界有数十个

实验室开展了鱼类基因转移研究,建立了显微注射、电融合及精子携带法等多种基因转移方法,获得了快速生长的转基因鲤、大马哈鱼、虹鳟、大西洋鲑和罗非鱼等,规模化养殖实验也在进行中。虽然基因工程定向育种技术已取得突破,但基因工程育种的目的还未能达到,外源基因的随机整合、非可控表达及转基因鱼生物安全性等问题,严重影响了这一基因工程育种技术在鱼类育种上的有效应用,成为制约转基因鱼研究进一步发展和推广应用的瓶颈。因此,开辟一条基因工程育种新途径的研究显得十分迫切和必要。利用同源重组进行内源基因修饰与可控表达及基因修饰鱼克隆技术的建立,对鱼类基因工程育种、生物反应器研制以及基因功能与表达调控和发育生物学研究,都具有重大理论指导意义和潜在应用价值。由于斑马鱼为模式鱼,其遗传背景清楚、繁殖周期短、产卵过程可人为控制、怀卵量大、体外受精、胚胎透明便于观察等,并已具有成熟的转基因技术,因而已成为鱼类基因工程中基因同源重组、基因表达调控和基因功能研究的理想材料。

鱼类克隆研究始于1963年,是由我国学者童第周教授等率先进行的。20世纪70年代,中国科学院水生生物研究所参与合作,克隆了第一尾鲤鲫囊胚细胞核移植鱼。随后在80年代,中国科学院水生生物研究所将鱼类细胞培养与细胞核移植相结合,获得第一例体细胞克隆脊椎动物,即肾细胞核移植鲫鱼。转基因克隆鱼的研究,就是把基因转移和克隆技术结合起来,应用于鱼类,建立一套快速省时的鱼类基因工程方法,为培育鱼类新品种和建立生物反应器提供技术储备。该项研究可以缩短培育纯系转基因鱼的时间,提高目的基因整合率,具有广泛的应用前景。目前,模式动物斑马鱼的细胞核移植研究已在国内外实验室获得成功,鉴于斑马鱼的类胚胎干细胞研究已取得进展,它将为斑马鱼基因组定向整合技术奠定基础,并有望在研究脊椎动物发育过程的基因功能、细胞核发育潜能及核质关系等理论问题上发挥重要作用。

[39～41]

[37,38]

2　斑马鱼基因工程发展前景

2.1　靶向筛选的转基因鱼类

过去大部分的研究集中在利用转基因斑马鱼进行发育基因表达和活体形态发生等方面,今后须考虑利用荧光标记鱼来筛查突变体、小分子或抑制正常发育的毒素。基因荧光标记鱼类与反求遗传学方法联合起来可以分析在特殊的发育途径中已知基因的作用规律。迄今为止,在斑马鱼中还不可能做到定点基因失活(targetedgenedisruption)。当前,最常用的定点基因失活方法是将吗啉代(morpholino)注射到早期的胚胎中,吗啉代其实就是修饰的反义寡核苷酸,能够特异消减(knock-down)基因表达[42]。然而,与用胚胎细胞培养产生种系嵌合体和用胚胎性成纤维细胞核代替合子核而产生克隆斑马鱼两种技术相比,能够产生真正的基因敲除鱼的方法才略显曙光[43,41]。就正常发育而言,利用组织特异和途径特异的基因消减或基因敲除的转基因种系可以为在活体内观察动态过程提供可能性,以便理解这个基因在脊椎动物胚胎发育中是怎样起作用和何时、何地起作用的。

除了筛选影响正常发育的突变以外,斑马鱼还可用于筛查阻断特殊发育途径的小分子。最近的研究显示,8/1100合成的小分子对发育的中枢神经系统、心血管系统、耳或色素的正常形成有促进作用[44]。除了能发现影响正常发育的小分子以外,还可以用表型模拟人类疾病的鱼筛选具有治疗价值的小分子[45]。此外,荧光标记鱼还可提高手工筛选的通量,并且可引导向自动筛选的方向发展。与此相关的生态发育生物学研究新领域,也将从荧光标记鱼中受益。倘若调控途径能够受控于活体转基因斑马鱼,这些鱼就可以作为环境污染物的指示器而发挥重要作用[46]。据报道,有3种方法用转基因斑马鱼检测环境有害化学物:一种是利用携带了整合高拷贝数量的大肠杆菌穿梭载体的斑马鱼来测试环境诱变剂[47]。Udvadia等学者正在设计荧光转基因斑马鱼,以此荧光定位的转换(例如从细胞核到细胞质位置)来测试诱变剂的活性,这种方法具有高通量筛选诱变剂的潜力;第二种方法利用标记转基因斑马鱼,其荧光或荧光素酶受到一种启动调

WUYu-Pingetal.:TheResearchProgressofZebrafishGeneEngineering1171

环境污染物如芳烃、重金属和环境雌激素的影响[46];第三种可能性是利用组织限制的荧光标记鱼来筛选对特殊发育途径产生特别作用的环境毒素。综上所述,转基因斑马鱼不仅可以服务于阐明自然的发育事件,而且可以用来促进发育途径中某些重要成分的发现,以及评估环境对这些相同途径的作用。

2.2　斑马鱼转基因技术的发展

在大多数情况下,DNA显微注射由于其相对操作简单、效果可靠,仍为斑马鱼转基因研究的主要方法。应用DNA显微注射获得斑马鱼种系转基因频

[48]

率为10%～30%,而在小鼠则为10%～

带大范围核酸酶(meganuclease)识别位点的转基因载体一并注入,该项技术可产生高达30%的转基因效率、50%的种系传递率和单拷贝或低拷贝数量的整合事件。如果这种方法同样在斑马鱼转基因

研究中也获得成功,它将为大多数实验室提供一种更加稳定、高效、简捷的转基因方法。目前,Sanger中心已完成斑马鱼基因组测序及组装,使得我们非常方便地利用序列信息鉴定和分离感兴趣基因的启动调控区域,序列信息还将使开展斑马鱼同源重组技术的实验室受益,因为它使得内源基因的切割、置换和修饰成为可能。这些技术,尤其是当它们被发展为仅需要简单的DNA注射时,便使斑马鱼成为分析蛋白质结构和功能的理想工具。2.3　斑马鱼基因工程的热点问题与应用前景

鱼类胚胎干细胞和基因靶向操作的研究目前尚处于起步阶段,尽管在斑马鱼和青鳉上已经建立了类ES细胞系,在青鳉上也获得了ES细胞移植的嵌合体,但迄今为止尚未得到能传递给后代的种系嵌合体,而这一步对于进行鱼类基因靶向操作是至关重要的一步。在基因靶向操作技术方面,目前已构建了斑马鱼生长激素基因同源重组载体(吴玉萍等,待发表)和青鳉p53基因同源重组载体;有学者预测鱼类基因靶向操作的研究将在斑马鱼或青鳉上首先获得成功,随后将向经济养殖鱼类推广。2002年,Lee等[41]在国际上首次将整合外源绿色荧光蛋白(GFP)基因的斑马鱼长期培养的胚胎细胞核移植到同种鱼的去核卵中,研制出了可成活的二倍体后代。这一重大进展为细胞核移植在鱼类基因工程育种上的应用奠定了重要基础。因此,细胞核移植和胚胎干细胞培养及基因靶向操作技术相结合,在鱼类基因工程育种应用上前景广阔。

斑马鱼基因工程中的基因敲除技术可以使我们极为精确的操作单个基因,遗传改变非常清楚,可以研究以前经典遗传学无法了解的基因表达效应,对于搞清每个基因的作用无疑是一个重要的里程碑。但这一技术也带来一些难以预见的问题。近来人们争论的焦点是动物机体是否有冗余基因,基因敲除模型的表型是否是由突变的靶基因造成的。目前,基因敲除的结果部分忽略了背景基因的作用,由于敲除基因的缺失,机体可能产生一种雪崩式的代偿过程,引起基因的第二次改变,因此有理由相信一个[54,55]

[53]

40%。在小鼠和斑马鱼中,通常导致转基因多聚

体的单一整合。复杂整合事件将为染色体内重组提供基本条件,并将导致表达变异。为了充分利用斑马鱼和其他脊椎动物模型,降低整合位点的复杂性,减少嵌合体和提高转基因效率,目前又发展了其他转基因方法。

对于斑马鱼,可采用拟型反转录病毒感染方法。早期采用反转录病毒介导的转基因实验,没有产生基因表达作用[9,13]。随后有学者报道,整合进入病毒载体的非病毒启动子或基因捕获确认的内源基因启动子调控的报道基因可以获得表达[48,50]。这种方法非常高效,每个转基因奠基者平均有25个独立分开的单拷贝插入序列[50]。然而,反转录病毒介导的转基因所需的构建、包装、滴定和感染是一个相当长的过程,远不适应于常规的转基因斑马鱼启动子或基因功能的分析。

第二种产生单拷贝转基因插入序列的方法是利用转座子操作[51,52]。相对于反转录病毒操作而言,转座子具有两大优势:1)它可以建立更大规模的转基因体系;2)其准备时间与DNA显微注射技术相近。这种方法的主要缺陷是效率极低,整合不到位,而且质粒DNA多聚体为随机整合[52]。

还有一种转基因替代方法适用于盘基网柄菌(Dictyostelium),是将转染的精核注入蛙卵原核,可产生60%～80%转基因胚胎。受试的F0代中100%可产生携带并表达基因的后代。尽管此种方法与DNA显微注射相比,需要更高的技术支撑,但它在斑马鱼基因工程应用中前景乐观[18]。

最近,在转基因青鳉中报道了一种更简捷的方法[49]

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本文编号：141910