柿脂氧合酶及其相关基因与果实成熟软化的关系研究

发布时间：2018-01-19 10:40

  本文关键词： 柿果实 脂氧合酶 免疫亚细胞定位 启动子 非生物胁迫 转录组　出处：《西北农林科技大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：脂氧合酶(LOX,EC1.13.11.12)广泛存在植物体内,启动生物膜上不饱和脂肪酸(PUFAs)发生过氧化反应,生成一些列生物活性物质,在植物生长发育、果实成熟衰老和胁迫应答等方面发挥重要功能。柿(Diospyros kaki L.)果实富含营养物质且风味独特,是我国北方重要的园艺经济产品。但是柿果实采后易软化,影响其鲜果的运输,造成严重的经济损失。本研究以不同耐贮性柿品种果实为材料,分析了9-LOX与果实成熟软化的关系及其对采后胁迫的应答,探讨了13-LOX在果实成熟软化中的作用。主要获得了以下的研究结果:1、利用RACE技术,从‘干帽盔’柿果实克隆获得2个LOX基因,DkLOX3(KF035131)和DkLOX4(KF035132)。同源基因聚类分析表明DkLOX3/4均属于9-LOX。柿果实DkLOX3/4基因在大肠杆菌中表达,通过Western blotting鉴定和蛋白纯化,获得DkLOX3/4融合蛋白。体外酶促反应试验分析表明,DkLOX3/4具有脂氧合酶活性。2、利用qRT-PCR检测不同耐贮性柿品种(耐贮性弱的‘富平尖柿’、耐贮性中等的‘火柿’和耐贮性较好的‘干帽盔’)果实成熟软化过程中DkLOX3/4基因的表达模式,并对‘富平尖柿’和‘干帽盔’进行丙烯和1-MCP处理,来探讨DkLOX3/4与乙烯的关系。qRT-PCR分析发现,DkLOX3/4基因在不同柿品种果实成熟软化过程中大量表达,并且具有不同的表达模式。DkLOX3基因表达量显著高于DkLOX4。此外,与DkLOX4相比,DkLOX3基因表达被丙烯处理显著上调,被1-MCP处理显著下调。3、利用扫描电镜观察贮藏期间‘富平尖柿’和‘干帽盔’果皮结构变化特性。果皮表面电镜观察发现,2个柿品种果实的果皮表面均没有皮孔结构;采收当天果皮角质层上均没有明显的微裂纹特征,贮藏12 d后微裂纹数量明显增多且加深。‘富平尖柿’果皮的微裂纹要比‘干帽盔’上的深。4、利用免疫胶体金结合透射电镜,探讨‘富平尖柿’和‘干帽盔’果实成熟软化过程中DkLOX3/4与细胞超微结构变化的关系。结果发现,贮藏12 d后,与‘干帽盔’相比,大量的DkLOX3金颗粒在‘富平尖柿’果肉细胞中迅速积累;但在相同时期2个柿品种果肉细胞标记的DkLOX4金颗粒数目均无明显变化。此时‘富平尖柿’比‘干帽盔’成熟软化快。这些结果表明DkLOX3在细胞超微结构改变中发挥重要作用,从而促进柿果实的成熟软化。5、利用qRT-PCR分析‘富平尖柿’果实成熟软化过程中DkLOX3/4基因对不同物理和外源激素处理的响应模式。分析发现经不同处理后,DkLOX3基因的表达模式基本与乙烯释放量的变化趋势相一致。机械损伤和外源ABA处理显著诱导DkLOX3基因的表达;而低温、外源SA和GA处理抑制了DkLOX3基因的表达。但特别的是,外源MeJA处理后,DkLOX3基因的表达模式不同于乙烯释放量的变化趋势。而DkLOX4基因与DkLOX3不同,除外源ABA处理抑制DkLOX4基因的表达,其他处理都不同程度的诱导DkLOX4基因的表达。6、利用染色体步移法克隆获得DkLOX3/4基因启动子序列,命名为pDkLOX3和pDkLOX4,基因登录号分别为KX779272和KX792109。烟草瞬时转化试验证明,DkLOX3/4基因启动子具有转录活性。另外,构建DkLOX3/4基因启动子缺失体探讨启动子如何调控不同9-LOX基因对非生物胁迫的响应。GUS活性分析表明,不同非生物胁迫都能诱导DkLOX3/4基因启动子的活性。根据DkLOX3/4基因启动子缺失体对不同非生物胁迫的响应情况,推测TGACG motif可能在DkLOX3基因对MeJA响应中发挥重要作用;TCA element在SA对DkLOX3/4基因启动子的诱导中具有重要作用;TATC-box、P-box和GARE motif在GA对DkLOX4基因启动子的诱导中发挥重要作用。7、利用RNA-seq技术对丙烯和1-MCP处理的‘富平尖柿’果实进行转录组分析。在不同处理柿果实转录组对比分析中获得了41,301条差异表达基因,统计丙烯处理果中基因差异表达倍数在2以上的基因有1868个,1246个基因被乙烯显著上调,622个基因被显著下调。进一步根据KEGG富集分析,筛选出柿果实中与LOX pathway相关的关键基因。8、探讨了柿果实LOX途径中13-LOX pathway在非生物胁迫应答中的作用。根据转录组测序结果,克隆获得13-LOX pathway相关关键基因DkLOX5/6、DkHPL和DkAOS。同源基因聚类分析表明DkLOX5/6均属于13-LOX;DkHPL属于13-HPL,DkAOS属于13-AOS。qRT-PCR分析发现,机械损伤和外源MeJA处理可以显著诱导DkLOX5/6、DkHPL和DkAOS基因表达升高;低温处理抑制DkLOX5/6基因的表达,诱导DkAOS、DkHPL和DkERF22基因表达升高;另外,外源ABA处理诱导DkLOX5/6、DkAOS、DkHPL和DkERF26基因表达升高。
[Abstract]:In this study , two LOX genes , DkLOX3 ( KF035131 ) and DkLOX4 ( KF035132 ) were obtained from persimmon fruits . The expression pattern of DkLOX3 / 4 gene was significantly higher than that of DkLOX3 . DkHPL belongs to 13 - HPL , DkHPL belongs to 13 - HPL , and DkHPL belongs to 13 - HPL . DkHPL belongs to 13 - HPL , DkHPL and DkHPL , DkHPL and DkERF22 gene expression are increased , and the expression of DkLOX5 / 6 gene is induced by low temperature treatment .

【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S665.2

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本文编号：1443812