女性苗勒氏管发育异常EMX2基因筛查和HOXA10基因、EMX2基因、TENM1基因在不全子宫纵隔患者分泌中期子宫内膜中

发布时间：2018-01-22 00:04

  本文关键词： 女性苗勒氏管发育异常 EMX2 基因 微小 RNA 3’UTR 不孕症 不全子宫纵隔 基因表达　出处：《安徽医科大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的在女性苗勒氏管发育异常(müllerian duct anomalies,MDAs)患者中寻找EMX2基因外显子及侧翼序列可能存在的基因突变,对新发现基因突变进行功能实验,期待发现女性苗勒氏管发育异常的原因。方法收集在我院确诊为女性苗勒氏管发育异常的患者静脉血标本162例,正常对照组静脉血标本100例,再利用改良盐析法提取外周血细胞中的DNA,使用引物设计软件Prime 5.0设计EMX2基因外显子及侧翼序列引物,以患者提取的外周血DNA为模板,通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR),分别扩增EMX2基因3个外显子及其侧翼序列,将出现目的条带的PCR产物进行纯化和测序,将测序产生的图形文件利用Chromas 2.31软件读取测序图,按照突变测序图要求找出新发突变。对新发现的突变运用双荧光素酶报告基因系统进行功能实验。结果在162例女性苗勒氏管发育异常患者外周血DNA中未发现EMX2基因外显子区域存在碱基突变。在一名子宫纵隔(不全性)患者EMX2基因3’非编码区(untranslated region,UTR)发现一个碱基变异*6(TG),通过生物软件进行预测,发现该变异位点存在两个微小RNA(micro RNA4307和micro RNA1258)与变异区域结合,并且其中该变异位点位于micro RNA4307种子结合区域。100名正常对照EMX2基因外显子区域未发现突变,3’UTR也未发现变异位点。我们利用多种生物信息学预测软件发现micro RNA4307和micro RNA1258在EMX2基因3’UTR存在多个结合区域,应用双荧光素酶报告基因系统证实micro RNA4307和micro RNA1258分别能与EMX2基因3’UTR结合。对含有该变异位点的区域利用双荧光素酶报告基因系统进行功能实验,结果发现micro RNA4307和micro RNA1258不与EMX2基因3’UTR碱基变异*6(TG)结合。结论在EMX2基因外显子区域未发现突变,该基因可能与苗勒氏管发病不相关。女性苗勒氏管发育异常患者(不全子宫纵隔)EMX2基因3’UTR存在碱基变异*6(TG),3’UTR单个碱基变异可能不影响EMX2基因的表达。EMX2基因是micro RNA4307和micro1258调控靶基因。目的HOXA10基因�QEMX2基因是两个参与苗勒氏管形成发育和胚胎着床的重要转录因子。HOXA10基因与EMX2基因5’端一段150 bp调控元件结合来抑制EMX2的表达。TENM基因编码的是一组保守的Ⅱ型跨膜蛋白,EMX2调控TENM1基因的表达。本课题的研究目的是利用实时荧光定量聚合酶链反应(Quantitative Real-time PCR)和蛋白质印迹法(Western Blot)的方法探讨HOXA10基因�QEMX2基因�QTENM1基因在原发不孕症(不全子宫纵隔)患者分泌中期子宫内膜的m RNA和蛋白表达情况,揭示HOXA10基因�QEMX2基因�QTENM1基因在不孕和不全子宫纵隔发生中的作用。方法首先选取在我们医院诊断原发不孕症(不全子宫纵隔)患者13例,同时选取12例对照组(正常子宫),所有研究对象均通过经阴道超声(transvaginal ultrasound,TVS)诊断为不全子宫纵隔,排除其他原因导致不孕症。从月经周期第10天开始利用TVS检测卵泡发育情况,待卵泡发育成熟检测黄体生成素(luteinizing hormone,LH)峰结合TVS判断卵巢排卵日期,在分泌中期(月经周期的19 23天)行宫腔镜检查同时留取子宫侧壁内膜组织,处理后置于低温冰箱保存。后期利用Real-time PCR和Western Blot方法,检测原发不孕症组(不全子宫纵隔)和对照组(正常子宫)分泌中期子宫侧壁内膜组织中HOXA10基因�QEMX2基因�QTENM1基因m RNA和蛋白表达情况。结果在13例原发不孕症(不全子宫纵隔)组和12例对照组(正常子宫)分泌中期子宫侧壁内膜组织中均检测到HOXA10,EMX2,TENM1的m RNA和蛋白表达。HOXA10基因在原发不孕症(不全子宫纵隔)患者分泌中期子宫内膜组织的m RNA较12例对照组(正常子宫)的分泌中期子宫内膜组织表达下降52%,差异有统计学意义(P0.01),蛋白表达下降了51%,差异有统计学意义(P0.01)。EMX2基因在原发不孕(不全子宫纵隔)患者分泌中期子宫内膜组织的m RNA和蛋白表达水平均较和12例对照组(正常子宫)的分泌中期子宫内膜组织表达量增加,m RNA升高2.396倍,差异有统计学意义(P0.01),蛋白表达水平升高2.504倍,差异有统计学意义(P0.01)。TENM1基因在原发不孕(不全子宫纵隔)患者分泌中期子宫内膜组织的m RNA和蛋白表达水平均较和12例对照组(正常子宫)的分泌中期子宫内膜组织表达量增加,m RNA升高2.270倍,差异有统计学意义(P0.01),蛋白表达水平升高1.597倍,差异有统计学意义(P0.01)。结论HOXA10基因、EMX2基因、TENM1基因均在分泌中期子宫内膜中表达。HOXA10基因在原发不孕症(不全子宫纵隔)患者分泌中期子宫侧壁内膜组织中m RNA和蛋白水平均低于对照组(正常子宫),提示HOXA10基因的表达降低参与不孕症的发生,可能参与的不全子宫纵隔的发病。EMX2基因在原发不孕症(不全子宫纵隔)患者分泌中期子宫侧壁内膜组织中m RNA和蛋白水平均高于对照组(正常子宫),提示EMX2基因的表达增高参与不孕症的发生,可能参与的不全子宫纵隔的发病。TENM1基因在原发不孕症(不全子宫纵隔)患者分泌中期子宫侧壁内膜组织中m RNA和蛋白水平均高于对照组(正常子宫),提示TENM1基因的表达增高参与不孕症的发生,可能参与不全子宫纵隔的发病。HOXA10基因在原发不孕症(不全子宫纵隔)患者分泌中期子宫侧壁内膜组织中m RNA和蛋白表达降低,导致EMX2基因表达增高,进一步引起TENM1基因的表达增高可能是不孕症发生和不全子宫纵隔发病的原因。
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本文编号：1452961