肽核酸阻断γ→β珠蛋白基因转换对γ珠蛋白基因表达的影响

发布时间：2018-01-24 21:39

  本文关键词： 地中海贫血 肽核酸 PYR复合体 细胞转染 基因治疗　出处：《贵州医科大学》2016年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的:通过肽核酸(peptide nucleic acid,PNA)封闭PYR(polypyrimidine complex)的DNA结合序列(γ-δ基因间序列),人为激活γ-珠蛋白基因的表达,从而探索一条β-地中海贫血基因治疗的新途径。方法:1.肽核酸的设计:本研究一共设计三条肽核酸(1)PYR-PNA,与PYR的DNA结合序列互补结合,用于阻断γ→β珠蛋白开关;(2)β-PNA,与β-珠蛋白基因转录起始区序列互补结合,用于下调β-珠蛋白基因表达;(3)Scr-PNA,即随机序列PNA(Scramble PNA),作为随机对照PNA。2.肽核酸的转染效率及细胞毒性试验:以阳离子脂质体lipofectamine2000为载体,将标记有FITC荧光基团的PYR-PNA转染K562细胞,在荧光显微镜下观察并计算其转染效率,采用Cell Counting Kit(CCK-8)检测其细胞毒性,应用正交试验筛选出最佳转染条件,并优化稀释培养基血清浓度,以获得最优的转染效果。3.肽核酸对γ-珠蛋白基因表达的影响:首先,对于K562细胞,实验分为3个实验组和2个对照组,实验组包括PYR-PNA组,β-PNA组,PYR-PNA+β-PNA组;对照组包括Scr-PNA组,空白对照组(无PNA的脂质体)。根据最佳转染条件,各组PNA经脂质体介导转染K562细胞,于转染后24h、48h和72h,用Real Time-PCR和Western blotting分别在转录水平和合成水平检测各组γ-珠蛋白基因的表达,比较各组γ-珠蛋白基因表达量的差异。结果:1.细胞最佳转染条件结果:以2.5-3×105/mL的细胞密度接种,每100μl的培养基中加入PNA6.25pmol,PNA与脂质体的体积比为1:3.5,稀释和孵育脂质体和PNA时不加胎牛血清,在转染5h后加入50μl胎牛血清,转染48h效果最好。2.细胞毒性及转染效率结果:经过条件优化,K562细胞转染效率达到87.2%,细胞存活率(relative growth rate,RGR)为94.1%。3.Real Time-PCR结果:PYR-PNA组转染后24h、48h和72h,γ-珠蛋白基因表达量比对照组分别增加1.702倍、2.036倍和1.498倍,与随机对照组比较差异均有统计学意义(P0.01);β-PNA组转染后24h、48h和72h,γ-珠蛋白基因表达量比对照组分别增加1.374倍、1.436倍和1.132倍,与随机对照组比较24h差异有统计学意义(P0.05);PYR-PNA+β-PNA组转染后24h、48h和72h,γ-珠蛋白基因表达量与随机对照组比较差异均无统计学意义(P0.05);β-PNA组、PYR-PNA+β-PNA组与PYR-PNA组两两比较差异均有统计学意义(P0.01)。4.Western blotting结果:PYR-PNA组转染后24h、48h和72h,γ-珠蛋白表达量比对照组分别增加1.608倍、2.488倍和1.575倍,与随机对照组比较差异有统计学意义(P0.01);β-PNA组转染后24h、48h和72h,K562细胞γ-珠蛋白表达量比对照组分别增加1.330倍、1.422倍和1.059倍,与随机对照组比较24h(P0.01)、48h(P0.05)差异有统计学意义;PYR-PNA+β-PNA组转染后24h、48h和72h,K562细胞γ-珠蛋白表达量比对照组分别增加1.334倍、1.784倍和1.177倍,与随机对照组比较24h、48h差异有统计学意义(P0.01);β-PNA组、PYR-PNA+β-PNA组与PYR-PNA组两两比较差异均有统计学意义(P0.01)。结论:1.通过条件优化,PNA可通过阳离子脂质体有效转染K562细胞;2.PYR-PNA可显著提高K562细胞中γ-珠蛋白基因在转录水平和翻译水平的表达;3.本研究为进一步探索γ-珠蛋白基因表达机制及β-地中海贫血基因治疗的研究方法提供了新的思路。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：贵州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R556.61

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本文编号：1461091