抗增殖蛋白基因过表达改善大鼠糖尿病心肌病的作用及机制研究

发布时间：2018-01-31 17:07

  本文关键词： 抗增殖蛋白 心肌纤维化 凋亡 糖尿病心肌病　出处：《山东大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景糖尿病性心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM)是指发病于糖尿病患者中,不能用高血压、冠状动脉粥样硬化、心脏瓣膜病以及其他心脏病变来解释的心肌疾病。研究发现,心血管疾病的发病率和死亡率在糖尿病患者中均占首位。即使没有众所周知的危险因素如冠状动脉疾病和高血压,糖尿病患者罹患心肌病的发展风险也会增加。非侵入性研究显示,左心室收缩、舒张功能不全以及左心室肥大均可在糖尿病心肌病,尤其是在合并高血压和冠状动脉微循环障碍的患者中观察到。当糖尿病患者出现左心室舒张功能障碍后,会发生胶原蛋白结构的继发改变,特别是胶原蛋白交联以及晚期糖基化终末产物的增加。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)是心肌重构过程中能够起关键作用的一种蛋白酶,与基质金属蛋白酶组织抑制因子(tissue inhibitors of matrix metal loproteinase, TIMP)维持着微妙的平衡。在糖尿病心肌病中,这种平衡被打破,造成胶原的异常沉积。过往研究发现,MMP2可以激发大鼠心肌成纤维细胞中胶原蛋白Ⅰ(collagen Ⅰ, COL Ⅰ)的表达,且MMP的表达与心肌纤维化的严重程度相关。细胞外基质(extracellular matrix, ECM)(主要是胶原蛋白Ⅰ,胶原蛋白Ⅲ(collagen Ⅲ, COL Ⅲ))的过度生产,可以改变心脏的结构和功能,是糖尿病心肌病最重要的病理特征之一。心肌细胞持续凋亡是造成心肌肥厚和纤维化的另外一个重要标志,抑制心肌细胞凋亡可以有效阻止糖尿病心肌病的进展。氧化应激是导致糖尿病并发症发生和发展的主要因素。在高血糖环境下,心肌细胞内氧化应激水平增加,并且能够释放一系列细胞因子及活性氧产物,触发心肌细胞死亡信号通路。另外,氧化应激和胰岛素抵抗以及胰岛素分泌受损也密切相关。抗增殖蛋白(Prohibitin, PHB)是一种高度保守的多效性蛋白质,广泛表达于真核细胞中,如线粒体、细胞核和细胞膜等。它涉及多种细胞功能包括增殖、凋亡、肿瘤抑制、转录和线粒体蛋白质折叠,其最有特征性的功能是作为线粒体的伴侣蛋白。研究表明,PHB缺乏可导致线粒体膜去极化并促进活性氧的生成继而诱发凋亡,而PHB过表达可以通过缓解氧化应激引起的损伤来降低心肌细胞线粒体的凋亡水平。另外,Supale等报道PHB基因过表达与肝脏及肾脏的纤维化水平呈负相关,并能提高H2O2刺激下新生鼠心肌原代细胞的存活率。糖尿病心肌病的发生涉及多种多样的分子机制,其中经典的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和Akt信号通路与PHB密切相关,并能够被高糖激活,参与心肌细胞肥大、凋亡和心肌细胞因子介导的炎症。以上分析提示我们,PHB有可能在糖尿病心肌病的发病过程中发挥重要作用。因此,本研究将在大鼠2型糖尿病模型的基础上,研究PHB基因在糖尿病心肌病中的作用及其潜在的机制。研究目的1、研究PHB在大鼠糖尿病心肌病中的作用以及潜在机制。2、研究PHB对高糖诱导的新生大鼠原代成纤维细胞异常增殖,异常胶原分泌的影响。3、研究PHB对高糖诱导的H9C2心肌细胞凋亡的影响。研究方法第一部分1.慢病毒构建构建携带有大鼠抗增殖蛋白基因的慢病毒载体(Lv-phb+),同时设计携带有绿色荧光蛋白的慢病毒空载体(Lv-vehicle)作为阴性对照。2.实验用大鼠分组及处理60只雄性健康Sprague-Dawley (SD)大鼠(120-140 g)购自北京维通利华实验动物技术有限公司,适应性喂养一周后,进行葡萄糖耐量实验(intraperitoneal glucose tolerance test, IPGTT)并被随机分以下成四个实验组：(1)正常对照组(Con组)；(2)单纯糖尿病组(DM组)；(3)糖尿病+阴性对照组(DM+Lv-vehicle组)；(4)糖尿病+PHB过表达组(DM+Lv-phb’组)。正常对照组大鼠喂以普通基础饲料,其成分主要为：粗蛋白20%,粗脂肪3%,粗纤维3%,其他74%。其余三组糖尿病大鼠喂以高脂饲料,其成分主要为：脂肪34.5%,蛋白质17.5%,碳水化合物48%。4周后,进行葡萄糖耐量实验(IPGTT)及胰岛素耐量实验(intraperitoneal insulin tolerance test, IPITT),对于出现胰岛素抵抗的DM组大鼠,腹腔注射27.5mg/kg链脲佐菌(Streptozotocin, STZ), Con组大鼠腹腔注射同等剂量枸橼酸钠缓冲液。周后,检测DM组大鼠空腹血糖(Fasting blood glucose, FBG)水平,连续两次空腹血糖水平11. lmmol/L被认为造模成功。在糖尿病诱导后12周,两组糖尿病的大鼠分别通过颈静脉静脉注射5×107UT.50μ L携带PHB cDNA-GFP的慢病毒载体(中国,上海GenePharma)或同样体积的慢病毒空载体(中国,上海GenePharma)。在糖尿病诱导后16周,再次进行IPGTT及胰岛素耐量实验IPITT,并于显微镜下观察心肌组织中GFP的阳性率分析病毒转染效率。对老鼠均进行安乐死处理,同时留取血液和组织标本。3.生化指标的测定每4周大鼠禁食12小时后,内眦静脉取血,离心留取血清后检测血清甘油三酯(Triglycercide, TG),总胆固醇(Total cholesterol, TC)和血糖水平。4.心功能测定在糖尿病诱导后16周,应用BP-98A智能鼠尾无创血压计检测每组大鼠血压水平；并采用小动物超声检测仪通过二维,M超,脉冲多普勒以及组织多普勒超声心动图评价大鼠左室收缩和舒张功能。5.组织学染色4%多聚甲醛固定大鼠心脏组织,制作石蜡切片进行HE染色,马松染色和天狼猩红染色,观察心脏形态以及胶原沉积情况。免疫组化染色观察心肌组织内COL Ⅰ, COL Ⅲ的含量。末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定法(TUNEL)染色检测心肌细胞的凋亡率。6.分子生物学水平检测提取大鼠心肌组织蛋白,用蛋白质印迹(western blot)检测心肌组织中COL Ⅰ, COL Ⅲ,以及转化生长因子β Ⅰ(TGF-βⅠ)的含量。并采用caspase-3活性检测试剂盒检测心肌组织中caspase-3的活性。同时检测PI3K, Akt/p-Akt, ERK/p-ERK、JNK/p-JNK、P38/p-P38等信号通路分子蛋白的含量。第二部分1.细胞培养从新生3天内的SD大鼠乳鼠心脏组织中提取原代成纤维细胞(cardiac fibroblasts; CFs)。分为以下四组：正常对照组(Con组；5.5mM)；高糖组(HG组; 30mM) ;高糖+Lv-vehicle组(HG+Lv-vehicle组)；高糖+Lv-PHB-组(HG+Lv-PHB+组)。2.免疫荧光采用激光共聚焦显微镜检测正常条件下及高糖刺激条件下CFs内抗增殖蛋白的分布情况。3.细胞增殖检测采用EDU及CCK8试剂盒检测各组CFs的增殖情况。4.明胶酶谱采用明胶酶谱法检测CFs细胞内及培养基上清中MMP-2和MMP-9的活性。5.分子生物学水平检测提取CFs蛋白,采用western blot检测心肌组织中COL Ⅰ,COLⅢ,以及TGF-βⅠ的含量。第三部分1.细胞培养同上所述,将H9C2心肌细胞分为Con组、HG组、HG+Lv-vehicle组和HG+Lv-PHB+组。2.细胞内氧化应激水平检测采用荧光探针DHE试剂盒检测H9C2心肌细胞内的氧化应激水平。3.心肌细胞凋亡检测采用7-AAD/Annexin V-PE试剂盒检测H9C2心肌细胞的凋亡水平。4.分子生物学水平检测提取H9C2心肌细胞及线粒体蛋白,检测bax.bcl-2以及细胞色素c的蛋白表达水平。并采用caspase-3活性检测试剂盒检测心肌细胞中caspase-3的活性。统计学分析采用SPSS v16.0(SPSS Inc.,Chicago, IL)软件分析并处理数据,结果以均数±标准误(Mean±SEM)表示.研究结果第一部分1.大鼠生化指标经过4周的高脂肪饮食后,三组糖尿病组大鼠的腹腔内葡萄糖耐量实验和腹腔内胰岛素耐量实验的曲线下面积(AUC)均高于普通饮食组大鼠。20周后,糖尿病大鼠空腹血糖(FBG)、总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)水平明显高于正常对照组大鼠,但PHB过表达没有降低TC,TG和空腹血糖水平。然而,20周后,PHB过表达组大鼠胰岛素耐量实验曲线下面积低于对照组大鼠,说明糖尿病大鼠的胰岛素抵抗水平有一定改善。2.心脏形态和心功能在糖尿病组大鼠,PHB蛋白表达水平显著低于对照组,而PHB过表达能明显增加心肌组织中PHB的表达。20周后,糖尿病组大鼠呈现出离心性肥大的特点。实验末,糖尿病大鼠心脏左心室的射血分数(LVEF),短轴缩窄率(FS),舒张期二尖瓣环血流速度(E/A)以及E'/A' 均低于正常大鼠。相比之下,左室舒张末内径(LVEDd)高于正常饮食组大鼠。PHB过表达能显著改善这些心脏超声学指标：与空载体对照组相比,能显著提高LVEF,FS,E/A,E' /A'并降低LVEDd.糖尿病大鼠的血压略增加,但没有发现统计学意义。3.纤维化和凋亡水平马松染色和天狼猩红染色显示糖尿病大鼠心肌间质胶原累积显著高于正常大鼠。与空载体对照组相比,PHB过表达减少了间质以及血管旁的胶原蛋白沉积。同样,TUNEL染色显示,PHB能够改善糖尿病大鼠心肌组织的凋亡水平。4.分子生物学水平检测结果显示,糖尿病能够增加纤维化标志物COL Ⅰ, COL Ⅲ以及TGF-βⅠ的表达,与免疫组化结果相一致,PHB显著降低这些标志物的表达水平。另外,糖尿病显著增加心肌caspase-3活性和bax/bcl-2的比值,与TUNEL染色一致,PHB能够降低这些过量表达的凋亡相关指标。我们进一步研究发现,与正常大鼠心肌组织相比,糖尿病能够降低PI3K,p-Akt以及p-P38在心肌组织中的的蛋白水平,而PHB过表达可以提高这些蛋白的含量。并且,PHB可以降低高血糖引起的大鼠心肌组织中p-ERK蛋白的增高。第二部分1.PHB在成纤维细胞中的表达与定位蛋白印记实验结果显示,在高糖刺激下PHB随着时间的变化呈现出先增高后降低的趋势。通过激光共聚焦显微镜观察到,相对于正常环境,高糖环境下的成纤维细胞核中PHB表达增多。2.成纤维细胞增殖检测EDU及CCK8试剂盒检测结果表明,高糖可以促进CFs的增殖,而PHB过表达可以降低CFs的增殖水平。3.分子生物学检测与体内实验结果相似,蛋白印记实验显示,在高糖刺激的CFs蛋白中,COLⅠ, COLⅢ,以及TGF-βⅠ的表达均显著增高；明胶酶谱实验及western结果显示,高糖刺激同时能够增加MMP-2和MMP-9的含量及活性。PHB在体外依然能够降低这些纤维化标记物的表达并能降低MMP-2的表达。第三部分1.PHB在H9C2心肌细胞中的表达与成纤维细胞类似,在H9C2心肌细胞中PHB的表达亦呈现先是略微增高后逐渐降低的趋势,但是达到高峰的时间点不同。2.H9C2心肌细胞氧化应激水平检测DHE染色显示,与正常对照组相比,高糖刺激能够增加H9C2心肌细胞中活性氧的生成,而PHB过表达能有效降低心肌细胞内活性氧的产生。3.H9C2心肌细胞凋亡检测流式结果显示,PHB过表达能够降低高糖诱导的H9C2心肌细胞PE染色阳性率,即细胞的早期凋亡率。进一步在分子水平上,PHB不仅可以阻止高糖刺激引起的细胞色素c从线粒体释放到胞浆中,还可以降低细胞内bax/bCl-2的比值,以及caspase-3的活性。结论1.PHB基因过表达可以有效改善糖尿病大鼠的心功能及纤维化。2.PHB基因过表达对高糖诱导的新生大鼠原代成纤维细胞的异常增殖,异常胶原分泌起到有效缓解的作用。3.PHB基因过表达能够抑制高糖诱导的H9C2细胞心肌凋亡,改善心肌细胞内的氧化应激状态。4.PHB在糖尿病心肌病中的作用与PI3K/Akt以及MAPK信号通路相关。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R587.2;R542.2
，

本文编号：1479563