油桐KASII基因的克隆及表达研究

发布时间：2018-02-09 10:29

  本文关键词： 油桐 KASⅡ基因 克隆 原核表达 Southern杂交　出处：《中南林业科技大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：油桐是我国原产的古老树种,与油茶、乌桕、核桃并称为我国的四大木本油料作物,是具有代表性的经济林树种,有重要的经济价值。油桐通过植物脂类的生物合成途径将合成的油脂贮存于种子中。KAS全称全β-酮脂酰-ACP合酶,主要有3类,KAS Ⅰ、KASⅡ、K4SⅢ,在植物油脂的生物合成途径中,KAS基因家族起到关键性的作用,他们启动脂肪酸合成、参与决定脂肪酸的碳链结构,是脂肪酸合成的关键酶。KASⅡ在此过程中,具有增长碳链,决定C16增长为C18的功能,该过程不可逆,也是脂肪酸合成过程中的限速步骤。本研究对油桐KASⅡ基因进行克隆和表达的研究,对探索油桐脂肪合成的分子机制具有重要意义。本研究的主要结果如下:1、油桐KASⅡ基因的cDNA全长克隆,扩增得到903bp的序列,设计3'RACE及5'RACE引物进行RACE扩增,分别获得1124和1086bp的序列,得到完整的2064bp的cDNA序列。利用ORF Finder查找其编码区,得到1701bp的CDS序列并对其进行结构预测,得到该蛋白序列的二级结构。分析该蛋白质序列,获得其基本理化性质及其在细胞中的分布情况。2、油桐基因组提取与Sourthern blot检测。提取油桐种子基因组,根据已知的KASⅡ基因序列设计带有酶切位点的引物进行PCR扩增。电泳回收后单酶切该片段,得到带有酶切位点的目的片段。将该片段转膜固定后与探针杂交、免疫检测,结果表面KASⅡ基因在油桐种子基因组中至少有两个拷贝。3、油桐KASⅡ基因CDS序列克隆及原核表达。利用PCR扩增得到的CDS片段,连接pMD18克隆载体,转化大肠杆菌DH5α,获得CDs的克隆。根据已获得的油桐KASⅡ基因CDS序列,设计带有酶切位点的引物,扩增重组克隆质粒。得到大量重组质粒后进行酶切,回收目的片段并将其与酶切后的表达载体pGEX-4t-1连接,转化表达菌株Rosseta。获得大量表达载体后通过涂平板、PCR、酶切验证其阳性。对正确转化的表达菌株进行IPTG诱导表达,诱导成功后得到大小约为75KDa的特异条带,其诱导表达的合适条件为:18℃、220rpm、IPTG浓度为0.5mM诱导4小时。4、油桐KASⅡ蛋白的分析及纯化。诱导得到KASⅡ基因的表达蛋白后,破碎菌体细胞,得到细胞悬液,对上清液和蛋白沉淀分别进行PAGE电泳,分析蛋白的可溶性。结果表明该蛋白在沉淀中有特异条带,即其表达形式为包涵体沉淀。对沉淀进行洗涤,除去其表面糖类、线粒体DNA、其他表达蛋白等杂质后获得纯净的表达蛋白。通过本研究,获得了油桐KA4SⅡ基因的完整序列,明确了油桐KASⅡ的表达条件及其蛋白性质,为后期该基因的深入研究及蛋白质的功能研究奠定基础。
[Abstract]:Taulownia is an ancient tree species native to China. It is regarded as the four largest woody oil crops in China, along with Camellia oleifera, Sapium sebiferum and walnut, and is a representative economic forest tree species. It has important economic value. The synthesized oil is stored in seeds by the biosynthesis of plant lipids. KAS is the whole 尾 -ketolidyl-ACP synthase, and there are three kinds of KAS 鈪，

本文编号：1497722