七种免疫增强剂及其复方对猪圆环病毒2型基因工程疫苗的免疫增强作用研究

发布时间：2018-02-10 13:12

  本文关键词： PCV2 免疫增强剂 基因工程苗 角鲨烷 PoIFN-γ　出处：《扬州大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：猪圆环病毒2型(Porcinecircovirus2,PCV2)是一种猪群易感染的常见病原体,与多种猪群传染性疾病的爆发流行有关。最为常见的疾病是断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS),为有效控制及消灭PCV2的爆发流行,各国学者均致力于PCV2有效疫苗的研发。PCV2 Cap蛋白是目前研发PCV2基因工程疫苗的首选靶抗原。另有研究表明,免疫增强剂是一类免疫促进剂及免疫刺激剂,主要功能是增强机体的抗肿瘤、抗感染、纠正免疫缺陷能;免疫增强剂具有激活体内多种免疫活性细胞,增强机体特异性及非特异性免疫功能,还能发挥佐剂作用,强化与之配合使用的抗原免疫原性,从而加速诱导免疫应答反应。目前免疫增强剂种类很多。本研究对七种免疫增强剂进行筛选,包括黄芪多糖、人参茎叶总皂苷、盐酸左旋咪唑、角鲨烷、Poly(I:C),Po-IFN-y蛋白和Po-GM-CSF蛋白,目的是筛选对本实验室制备的PCV2-Cap蛋白疫苗有最佳增强效果的免疫增强剂。1.黄芪多糖、人参茎叶总皂苷、盐酸左旋咪唑、角鲨烷、Poly(I:C)对PCV2基因工程疫苗的免疫增强研究为探究免疫增强剂对PCV2基因工程疫苗的免疫增强作用,本研究制备了黄芪多糖、人参茎叶总皂苷、盐酸左旋咪唑、角鲨烷、Poly(I:C)等5种免疫增强剂+PCV2Cap疫苗。制备方法均按PCV2-Cap蛋白:Gel 01佐剂:免疫增强剂体积比为75:20:5来配置疫苗。采用腹腔注射方式免疫小鼠。21 d后进行攻毒试验,以鉴定5种免疫增强剂的免疫保护效力。采用间接ELISA方法测定免疫21 d血清PCV2特异性IgG抗体水平,结果表明,Poly(I:C)与角鲨烷两种增强剂能诱导疫苗产生更高水平的PCV2特异性IgG抗体,显著提高PCV2疫苗的免疫原性。CUSABIO试剂盒检测鼠免疫后21 d小鼠淋巴细胞经Con A刺激后上清当中IL-4、IL-6、IFN-γ细胞因子浓度,结果表明:角鲨烷能显著促进PCV2Cap疫苗诱导小鼠分泌IL-6和IFN-γ。Poly(I:C)仅有轻微促进作用。PCV2攻毒后21 d,采用荧光定量PCR检测PCV2病毒血症及脾脏的PCV2载量,结果表明:角鲨烷能辅助PCV2-Cap疫苗减轻攻毒后PCV2的病毒血症及降低脾脏病毒携带水平。因此,角鲨烷与PCV2-Cap蛋白混合免疫能显著增强PCV2-Cap疫苗的免疫保护作用;Ploy(I:C)虽然也能提高该疫苗的细胞免疫水平,但对病毒血症及脾脏病毒携带量的控制不如角鲨烷作用明显。2.黄芪多糖、人参茎叶总皂苷、盐酸左旋咪唑、角鲨烷、Poly(I:C)组成的复方对PCV2基因工程疫苗的免疫增强研究为探究复方免疫增强剂对PCV2-Cap蛋白疫苗的免疫增强作用,本研究根据免疫增强机制和搭配禁忌,从黄芪多糖、人参茎叶总皂苷、盐酸左旋咪唑、角鲨烷、Poly(I:C)5种免疫增强剂中挑选2到4种组合成6组复方,构成复方免疫增强剂+PCV2 Cap疫苗。制备方法均按PCV2-Cap疫苗:Gel 01佐剂:免疫增强剂体积比为75:20:5来配置疫苗。采用腹腔注射方式免疫小鼠。21 d后进行攻毒试验,以鉴定6种复方免疫增强剂的免疫保护效果。采用间接ELISA方法测定免疫21 d血清PCV2特异性IgG抗体水平。CUSABIO试剂盒检测鼠免疫后21 d小鼠血清当中IL-4、IL-6、IFN-γ细胞因子浓度。PCV2攻毒后21天,采用荧光定量PCR检测PCV2病毒血症。综合结果表明:黄芪多糖+盐酸左旋咪唑+Poly(I:C);黄芪多糖+盐酸左旋咪唑+角鲨烷+Poly(I:C);黄芪多糖+Poly(I:C)三组复方增强剂能辅助PCV2-Cap疫苗减轻攻毒后PCV2病毒血症。因此,这三组复方免疫增强剂和PCV2-Cap蛋白混合免疫能显著增强PCV2-Cap疫苗的免疫保护作用,三组中,黄芪多糖+Poly(I:C)组免疫增强效果最佳;其余三组复方疫苗虽然也能提高体液或者细胞免疫水平,但对病毒血症的缓解不如这三组作用明显。3.猪IFN-y与猪GM-CSF的表达和纯化通过PCR进行目的基因扩增、双酶切、与载体连接、转化、鉴定,制备PoIFN-γ-pCold I-Fh8和PoGM-CSF-pCold I-Fh8重组菌液;最终进一步对重组菌进行诱导蛋白表达,并且优化IPTG诱导浓度、时间,提高蛋白表达效率;最终,猪IFN-γ以包涵体形式表达,而猪GM-CSF大部分以可溶性形式表达。最后,采用GE蛋白纯化柱对蛋白进行纯化,获得浓度分别为1.6 mg/ml和2.6 mg/ml的猪IFN-y、猪GM-CSF两种细胞因子类重组蛋白。为进一步研究猪IFN-γ、GM-CSF两种细胞因子类蛋白对PCV2-Cap蛋白疫苗的免疫增强作用提供基础。4.猪IFN-]与猪GM-CSF对PCV2-Cap基因工程疫苗的免疫增强作用研究为探究PoIFN-γ、PoGM-CSF两种重组蛋白对PCV2-Cap蛋白疫苗的免疫增强作用,将研制的2种重组蛋白与PCV2 Cap蛋白疫苗混合,分别免疫小鼠,21 d后进行攻毒试验。采用间接ELISA方法测定免疫21 d血清PCV2特异性Ig G抗体水平,结果表明,PoIFN--γ重组蛋白能显著提高PCV2-Cap疫苗免疫产生的血清特异性IgG抗体水平(p0.05);PoGM-CSF重组蛋白未观察到此类增强效果(p0.05)。采用SYBR荧光定量PCR法检测鼠免疫后21 d脾脏淋巴细胞IL-4、IL-6、IFN-γ细胞因子基因mRNA表达水平,结果表明,PoIFN-γ重组蛋白能显著提高疫苗免疫后脾脏细胞IL-4、IFN-γ的m RNA表达水平。PCV2攻毒后21d,采用实时荧光定量PCR检测PCV2病毒血症及脾脏PCV2病毒载量,结果表明,PoIFN-γ重组蛋白能显著减轻攻毒后PCV2病毒血症,对PCV2病毒有明显抑制作用,并且能有效降低脾脏PCV2病毒载量。因此,PoIFN-y重组蛋白能显著增强PCV2-Cap疫苗的免疫保护作用,本研究为进一步测定其在猪体上的免疫增强作用奠定了基础。
[Abstract]:A new type of vaccine against PCV2 - Cap protein has been prepared by immunizing mice by intraperitoneal injection . Its main function is to enhance the anti - tumor , anti - infection and anti - immune deficiency of PCV2 . The immune enhancement of PCV2 - Cap vaccine was studied by means of indirect ELISA . The recombinant protein of porcine IFN - 纬 and GM - CSF could be used to enhance the immune function of PCV2 - Cap protein vaccine . The results showed that the recombinant protein of PoIFN - 纬 could significantly improve the expression level of IL - 4 and IFN - 纬 in spleen cells after vaccination .

【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S859.7

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本文编号：1500593