A型副鸡嗜血杆菌血凝素基因原核表达及间接ELISA方法的建立及应用
本文关键词: A型副鸡嗜血杆菌 血凝素蛋白 纯化 间接ELISA 出处:《动物医学进展》2017年12期 论文类型:期刊论文
【摘要】:原核表达A型副鸡嗜血杆菌(Haemophilus paragallinarum serotype A,Hpgserotype A)的血凝素蛋白HA,并以HA蛋白为包被抗原,建立血清间接ELISA检测方法。克隆Hpg HA基因,将其克隆至原核表达载体pET-28a(+)中进行重组HA蛋白的诱导表达,对表达产物进行纯化,并进行Western blot鉴定;用纯化后的HA蛋白作为包被抗原,优化反应条件,建立血清间接ELISA检测方法,并进行特异性、灵敏度和重复性试验,最后对临床样品进行检测。原核表达获得大小约为37ku的重组HA蛋白;Western blot结果表明重组蛋白具有良好的特异性和抗原反应性。Hpg间接ELISA优化反应条件为:抗原包被量每孔500ng,血清以1∶200倍稀释作用1h,酶标二抗以1∶2 500倍稀释作用1h,TMB显色时间为10min。在该优化条件下,OD_(450)≥0.34为阳性,反之为阴性;特异性试验结果表明对鸡新城疫病毒、禽流感病毒、沙门菌、金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌阳性血清检测均为阴性;对85份阳性血清进行检测,敏感性为98.8%;重复性试验结果表明,批内和批间OD_(450)值的变异系数分别1.5%~3.7%和6.5%~8%。用本试验建立的方法对临床上215份鸡血清样品进行检测,阳性率为25.1%。说明建立的ELISA检测方法可用于Hpgserotype A抗体水平的检测。
[Abstract]:The hemagglutinin protein of Haemophilus paragallinarum serotype A was expressed in prokaryotic expression of Haemophilus paragallinarum serotype Hpgserotype A, and the indirect ELISA detection method was established with HA protein as the coating antigen. The HA gene was cloned. It was cloned into the prokaryotic expression vector pET-28a () to induce the expression of the recombinant HA protein, then purified and identified by Western blot. The purified HA protein was used as the coated antigen to optimize the reaction conditions. To establish an indirect ELISA detection method for serum, and to carry out specificity, sensitivity and repeatability test. The recombinant HA protein of about 37 ku was obtained by Western blot. The results showed that the recombinant protein had good specificity and antigen-reactivity. The optimal reaction conditions of HPG indirect ELISA were as follows: antigen envelope quantity. At 500 ng / pore, the serum was diluted with 1: 200 times for 1 hour, and the enzyme labeled second antibody was diluted with 1: 2 500 times dilution for 1 h TMB for 10 min. Under the optimized conditions, the positive reaction time was more than 0.34. The results of specific tests showed that the positive sera of Newcastle disease virus, avian influenza virus, Salmonella, Staphylococcus aureus, Pasteurella multocida and Escherichia coli were all negative; 85 positive sera were tested. The sensitivity was 98.8. The results of repeatability test showed that the coefficients of variation of ODS450) were 1.5% and 6.5%, respectively. 215 chicken serum samples were detected by the method established in this experiment. The positive rate was 25.1%, which indicated that the established ELISA assay could be used to detect the level of Hpgserotype A antibody.
【作者单位】: 陕西省杨凌职业技术学院动物工程分院;
【基金】:陕西省科技攻关项目(2016NY-096) 杨凌示范区重大科技项目(2016-XY-16)
【分类号】:S852.61
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,本文编号:1504454
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