miR-106a靶向下调APC基因促进恶性胶质瘤细胞增殖和侵袭相关研究

发布时间：2018-02-13 03:19

本文关键词： miR-106a 胶质细胞瘤 WNT信号 APC 侵袭　出处：《新疆医科大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的:恶性胶质瘤细胞瘤是脑科最常见的原发性肿瘤,它是人类最致命的肿瘤之一,尽管在过去几十年的治疗中不断取得一些进展,但仍以脑外科治疗为主,愈后效率很差,在欧美地区5年生存率平均小于3%。探索新的治疗一直是科研工作者的追求。近年来,科学家发现非编码mi RNA在生命的调节过程中起到重要的作用,本课题就是从这方面出发,寻找在胶质瘤细胞和正常神经细胞中表达差异的mi RNA,通过过表达及干扰所研究的mi RNA,确定其对胶质瘤细胞相关功能的影响,并找出其可能的信号通路及调控的靶基因,这些是本课题研究的目的所在。方法:收集胶质母细胞瘤组织标本8例(脑胶质瘤外科手术获得),正常脑组织3例(脑外伤后需手术清除的脑挫裂伤组织)。正常神经细胞NHA以及胶质瘤细胞SNB19、U87MG、LN444、LN18、U251MG、U118MG。提取RNA后检测其纯度和浓度,运用QPCR技术进行检测mi R-106a的相对表达量。构建稳定表达mi R-106a的细胞株,从DNA模板中扩增包含mi R-106a前体的上下游多延长200bp的片段,构建慢病毒载体,包装成慢病毒,然后感染胶质瘤细胞,构建稳定表达mi R-106a和mi R-106a-sh RNA的细胞株,用于进行实验:1)MTT实验,接种细胞到96孔板中,分别培养1-4天,每孔中加入MTT溶液呈色,选择490nm波长进行比色,记录结果并绘制生长曲线;2)细胞周期检测,用PI染细胞核,用一定激发波长激发产生荧光,荧光的强度与细胞内DNA的含量成正比,激发的荧光基团强弱被机器识别后,可以读出细胞各个发育时期的变化水平;3)侵袭实验检测,37℃培养箱中,培养12h、24h、36h后,取出transwell小室,每组重复3个样本。其中1个小室弃去培养基,用无钙的PBS洗3遍,4%多聚甲醛固定10min,棉签擦掉上层未迁移的细胞,PBS洗3遍,结晶紫染色染色,在显微镜下观察。剩余3个小室将其下层迁移细胞用0.25%胰蛋白酶消化,计算迁移细胞数,或直接取几个视野计数取平均值;4)检测细胞中Sanil、RUNX2、CD44、SOX9、OCT4、ALP基因的表达相对水平,提取各组细胞中的RNA,逆转录后上机进行PCR反应;5)提取各组细胞中的蛋白,进行蛋白浓度及纯度检测,并绘制标准曲线,用WB法检测Cyclin D1、p-p Rb、p Rb、MMP2蛋白含量;6)染色质免疫共沉淀检测,提取核DNA并用超声波处理,进行MMP2、Nanog、C-myc抗体孵育,解离收集DNA并运用QPCR法进行DNA含量检测;7)运用试剂盒检测TOP/FOP的相对比值,用以检测β-catenin入核水平;8)荧光素酶检测mi R-106a与APC相互调控关系,同时检测APC-3’端突变体。结果:QPCR检测3例正常脑组织与8例胶质瘤组织数据所示,8例表达都高于正常组织,比较有统计学意义(P0.01)。胶质瘤细胞SNB19、U87MG、LN444、LN18、U251MG、U118MG相对正常脑细胞NHA都有统计学意义(F=0.233,P0.01)。MTT结果提示转了抑制mi R-106a的细胞比对照和过表达mi R-106a的细胞的生长速度慢,而过表达mi R-106a的细胞生长增殖快,从到达第4天时增殖的细胞数看,转染了抑制mi R-106a的达到了2.8的基数,而对照和过表达mi R-106a的基数分别为4.0和6.0。对细胞周期检测后结果显示,对照组G1/G0=60.46%,S=32.85%,G2/M=6.69%。过表达组G1/G0=32.29%,S=57.63%,G2/M=6.08%。抑制组G1/G0=73.71%,S=19.04%,G2/M=7.25%,过表达组细胞S期显著比对照组高,过表达mi R-106a后细胞增殖加快。侵袭实验显示,在3个不同的视野计数染色阳性细胞,过表达mi R-106a组阳性细胞数为3.53±0.13,明显比对照组高,统计(T=-33.71,P0.01),有统计学意义。而抑制mi R-106a组细胞阳性数为0.21±0.05,较对照组少,统计(T=27.37,P0.01),有统计意义。TOP/FOP结果显示,相对于对照组,过表达mi R-106a组其活性值为3.5±0.056,统计检测T=-74.66,P0.01。而抑制mi R-106a组其活性值为0.23±0.019,统计检测T=78.45,P0.01。CHIP结果显示基因MMP2、Nanog、c-My C的表达相对于对照组,过表达和抑制mi R-106a组都有意义P0.01。荧光素酶检测结果显示,相对于对照组,过表达mi R-106a相对荧光质为0.279±0.021(T=59.467,P0.01),而抑制组为1.832±0.076(T=-18.961,P0.01),而突变组相对对照组无统计意义。结论:我们的实验证实mi R-106a通过靶向调控APC基因,并通过WNT信号通路对人脑胶质瘤细胞的增殖产生影响,这为mi R-106a在针对人脑胶质瘤的治疗方式上提供了新的思路。所有的统计采用的统计软件SPSS 13.0进行数据分析。结果数据用均数±标准差((χ|-)±s)来表示。两个样本均数比较采用T检验,P0.05认为差异有显著意义。
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【学位授予单位】：新疆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R739.41

【参考文献】