斯氏副柔线虫转录组学和蛋白质组学研究及免疫相关基因鉴定

发布时间：2018-02-23 18:43

本文关键词： 斯氏副柔线虫转录组蛋白质组分泌基因/蛋白 iELISA　出处：《内蒙古农业大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：斯氏副柔线虫是一种寄生于反刍动物真胃的吸血性线虫,骆驼是其最适宜宿主。大量感染斯氏副柔线虫后,可导致骆驼拉稀、贫血甚至死亡,严重危害骆驼健康。在国内外,有关斯氏副柔线虫的基础理论研究,生前诊断和免疫防治研究均未见报道。本研究对骆驼斯氏副柔线虫虫卵、第三期幼虫、雌虫和雄虫分别进行转录组和蛋白质组学研究,并利用荧光定量PCR方法验证转录组分析结果,同时整合分析两组学数据,揭示不同发育阶段斯氏副柔线虫生物学特征,以探明不同发育阶段虫体在mRNA和蛋白水平上的差异,发掘免疫相关分泌性基因和蛋白,最终筛选了3个斯氏副柔线虫特有分泌基因进行重组表达和免疫原性鉴定;并利用重组抗原建立了斯氏副柔线虫病iELISA诊断方法,为该病的免疫防治研究奠定了基础。主要研究结果如下:1.通过对斯氏副柔线虫虫卵、第三期幼虫、雌虫和雄虫的转绿组测序,共获得超过10GB的有效数据量,拼接组装、优化处理数据后得到54102个Unigenes,其中33816个Unigenes为差异表达基因,32006个Unigenes具有功能注释。基因时序表达中描绘出4个阶段虫体的表达模式特征,虫卵阶段主要富集在蛋白质合成功能上;第三期幼虫阶段中幼虫发育和自身免疫保护等功能基因表达明显;雄虫主要富集在精子形成和能量代谢等功能;而雌虫主要富集在参与受精和激活精子进入等功能。qPCR检测了 12个各阶段高富集基因,结果有11个基因的表达趋势与转录组测序结果一致。比较转录组学研究中,对成对比较的差异表达基因进行统计,G0功能分类和KEGG代谢通路分析,推断出虫卵与第三期幼虫、第三期幼虫与成虫(coFemale/Male)、雌虫与雄虫的转录模式改变特征。预测了 1975个候选斯氏副柔线虫免疫相关分泌性基因,鉴定出多种重要的功能性分泌抗原基因。2.通过对斯氏副柔线虫第三期幼虫、雌虫和雄虫的蛋白质组学研究,共鉴定到2072个蛋白质,其中有2009(97.0%)个蛋白具有功能注释。对成虫和第三期幼虫、雌虫和雄虫比较的差异蛋白进行分析,结果表明成虫和幼虫的差异蛋白显著富集在幼虫发育、生长正调控和成虫寿命调控等功能分类中;主要参与核糖体,氧化磷酸化和丙酮酸盐代谢等通路。雌虫和雄虫的差异蛋白显著富集在生殖相关的功能分类中;主要参与细胞骨架调节、PPAR信号通路和血管平滑肌收缩等通路。筛选出197个分泌性蛋白,并对其表达情况进行了分析。3.对两组学数据中的差异基因/蛋白进行数量、表达量和功能分类比较关联分析,结果发现差异基因和差异蛋白的数量、表达量、功能分类和代谢通路调控在两组学水平上有较高的一致性。4.结合两组学预测的分泌性基因/蛋白数据,筛选出9个重要的分泌性基因作为斯氏副柔线虫免疫相关抗原的候选基因进行了克隆测序分析,并成功构建了BL21(pETSTPK)、BL21(pETCPI)和 BL21(pETCPR)三个重组表达系统。WB 检测发现重组蛋白rSTPK、rCPI和rCPR能够与感染斯氏副柔线虫的骆驼血清中的抗体发生特异性结合反应,具有较高的特异性和较好的免疫原性。5.以重组蛋白rSTPK、rCPI和rCPR作为抗原,成功建立了斯氏副柔线虫重组抗原rSTPK、rCPI和rCPR的iELISA诊断方法。利用建立的三个重组抗原iELISA诊断方法对81份已知阳性血清和9份已知阴性血清进行检测,发现三个重组抗原的特异性均为100%;重组抗原rSTPK、rCPI和rCPR的敏感性分别为97.5%、98.8%和96.3%,且均具有良好的重复性。通过对140份田间骆驼血清进行iELISA检测,发现建立的三个重组抗原iELISA检测方法在阳性检出率上无显著差异(P0.05),均可用于斯氏副柔线虫病的血清学诊断。
[Abstract]:In this study , we have studied the biological characteristics of P.S . parasequinata . The results of this study are as follows : 1 . It has been used to study the biological characteristics of the four stages of the disease . The results of this study are as follows : 1 . The research results are as follows : 1 . The study of the basic theory of the parasequindes , the third stage larvae , the female and the male . The results of this study are as follows : 1 . The study shows that the expression patterns of the four stages are different from those of the third stage larvae , the third stage larvae and the adult worms . The recombinant protein rSTPK , rCPI and rCPR were cloned and sequenced . The results showed that the recombinant protein rSTPK , rCPI and rCPR could be used as antigen to detect the specific binding of recombinant antigen rSTPK , rCPI and rCPR .

【学位授予单位】：内蒙古农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S852.7

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