半枝莲抗肿瘤活性成分筛选及AhR基因敲除的肝癌细胞的初步构建

发布时间：2018-02-25 06:27

  本文关键词： 半枝莲黄酮 HepG2细胞 CRISPR-Cas9 慢病毒载体　出处：《扬州大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：人体约80%～90%的肿瘤是由化学致癌物引起的。化学致癌物在进入体内后,要受到体内各种酶的代谢,Ⅱ相酶在防治肿瘤的发生和发展中起着至关重要的作用。半枝莲中黄酮类化合物能很好的清除体内的自由基,起到抗肿瘤的作用。课题组前期工作发现半枝莲黄酮类化合物能诱导Ⅱ相代谢酶的表达,但半枝莲黄酮类化合物种类众多,对于各化合物的作用及其机理仍未明确。因此,我们开展了对半枝莲黄酮类化合物活性成分及其机理的进一步研究。第一部分ARE调控的绿色荧光蛋白报告基因细胞对半枝莲不同极性部位的黄酮类化合物筛选目的:通过ARE(anti-oxidative response element,抗氧化反应元件)调控的绿色荧光蛋白报告基因细胞模型来筛选半枝莲7个不同极性部位的黄酮类化合物(A、B、C、D、E、F、G),初步探讨半枝莲黄酮类化合物活性成分。方法:使用终浓度为50μg/mL的黄酮类化合物(A、B、C、D、E、F、G)以及终浓度为100M的tBHQ(tertiary butylhydroquinone,叔丁基对苯二酚)分别对ARE调控的绿色荧光蛋白报告基因细胞HepG2-4ARE-TK-GFP处理24小时后检测细胞内GFP(Green fluorescent protein,绿色荧光蛋白)相对发光强度。并检测阳性黄酮类化合物G的剂量效应。结果:黄酮类化合物G显示结果为阳性,相对荧光强度为1.97倍,而黄酮类化合物A、B、C、D、E、F均为阴性。黄酮类化合物G浓度在80μg/mL时取得最大活性。结论:本实验对前期提取的7个不同半枝莲黄酮类化合物进行筛选,其中黄酮类化合物G为其主要活性成分。第二部分 AhR基因敲除HepG2细胞模型的的初步构建目的:通过 CRISPR-Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR associated system,CRISPR-Cas9基因编辑技术)基因打靶技术敲除Hep G2(Human hepatocellular liver carcinoma cell line,人肝癌细胞系)内的 AhR(aryl hydrocarbon receptor,芳香烃受体)基因,验证其可行性,为进一步构建AhR基因缺失的ARE调控的绿色荧光蛋白报告基因细胞Hep G2-4ARE-TK-GFP提供基础方法:针对AhR基因设计了三个sgRNA(small guide RNA,引导RNA)位点,合成其对应的oligo双链DNA后与线性的载体GV392连接后构建AHR-sgRNA载体。对构建的载体进行慢病毒包装后对培养的Hep G2细胞进行转染。将转染阳性结果抽提DNA后PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链式反应)扩增,使用错配酶法检测sgRNA活性结果:对AHR-sgRNA载体测序结果中找到了相应的sgRNA序列,在随后的感染后Hep G2细胞内sgRNA活性的检测中,三个sgRNA均表现出了活性,其中sgRAN3的活性最强。结论:本实验利用CRISPR-Cas9基因打靶技术成功敲除了 HepG2细胞内的AhR基因,成功构建了 AhR基因缺失的Hep G2细胞,验证了使用CRISPR-Cas9基因打靶敲除Hep G2细胞内 AhR基因的可行性,对下一步构建Nrf2/Keap1(nuclearfactorerythroid-2p45-related factor 2,核转录因子红细胞系-2p45 相关因子/Kelch-like ECH-associated protein 1 Kelch,样环氧氯丙烷相关蛋白1)信号通路单相诱导Ⅱ相酶表达的细胞模型的构建提供了基础。
[Abstract]:The activity and mechanism of flavonoids from Scutellaria barbata ( A , B , C , D , E , F , G ) were studied by means of a green fluorescent protein reporter gene cell model regulated by ARE ( anti - oxidative response element ) . The expression of AhR gene in HepG 2 cell line ( human hepatocellular carcinoma cell line ) was determined by PCR ( Polymerase Chain Reaction ) .

【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.7
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本文编号：1533373