利用RNAi技术进行中国野生葡萄SBP转录因子功能研究

发布时间：2016-10-25 20:43

  本文关键词：GH-DREB基因转化小麦及转基因植株后代的抗旱生理指标鉴定，由笔耕文化传播整理发布。

《西北农林科技大学》 2009年

利用RNAi技术进行中国野生葡萄SBP转录因子功能研究

侯鸿敏  

【摘要】： 葡萄白粉病(Uncinula necator)是严重危害欧洲葡萄的真菌病害之一。本课题组采用mRNA差异显示和RACE技术(mRNA differential display reverse transcription-PCR, DDRT-PCR)获得了中国野生葡萄华东葡萄(V. pseudoreticulata)白河-35-1在白粉病病原菌侵染后诱导表达的SBP(SQUAMOSA promoter binding protein, SBP)转录因子cDNA。本研究就是通过对中国野生葡萄SBP转录因子cDNA序列进行分析,根据其保守区、非保守区设计引物,分别构建以保守区和非保守区为目的基因的RNAi植物表达载体,通过花序浸润法转化拟南芥,初步了解SBP家族基因的功能。获得以下主要结果: 1.分别构建了中国野生葡萄SBP转录因子cDNA保守区和非保守区的RNAi植物表达载体。通过对中国野生葡萄SBP转录因子cDNA进行结构分析,预测基因保守和非保守区域。根据其保守和非保守区序列以及pENTRTMTOPO vector要求设计合成两对特异引物:SBPb-F5’CAC CGC AGG TTT GAC TCC CCT TCA CAT AG 3’, SBPb-R5’AGA GCC ACA CAT ACG CAG ACA GC 3’, SBPf-F5’CAC CGA AAA ATG CAA GCC AAG TAT CAA 3’, SBPf-R5’TCT CAA GAG GAG TTC CAC CAT AG 3’,并进行PCR扩增,将获得的目的片段定向连接到pENTRTM/D-Topo载体,经过PCR检测和测序分析得到正确入门克隆载体后,分别与目的载体pHellsgate8进行LR反应,利用PCR扩增和XHoI、XBaI单酶切检测鉴定,获得SBP转录因子保守区和非保守区的RNAi植物表达载体pHellsgate8-SBPb和pHellsgate8-SBPf。 2.获得了具有卡那霉素抗性的转基因拟南芥植株。通过农杆菌介导的花序浸润法转化拟南芥,在含卡那霉素40mg/L的MS培养基中对T0代转化植株的种子进行抗性筛选,获得了48株pHellsgate8-SBPb转基因拟南芥和63株pHellsgate8-SBPf转基因拟南芥。分别提取T1代转基因拟南芥的DNA,经PCR检测初步证明目的基因已导入拟南芥。 3.中国野生葡萄SBP转录因子功能分析。将野生拟南芥和转基因拟南芥转入基质中生长两个月后,对获得的抗性植株表型进行观察,在pHellsgate8-SBPb的转基因植株中发现一株不抽薹不开花的转基因突变体植株。与野生型拟南芥相比,其叶色浓绿且叶缘缺刻明显,营养生长旺盛,而其他抗性植株与野生型拟南芥相比,表现出生长势较弱,抽薹分枝数和角果数都较少。初步证明中国野生葡萄SBP转录因子可能与植株抽薹开花有关。

【关键词】：
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：S663.1
【目录】：

摘要5-7

ABSTRACT7-11

第一章 文献综述11-23

1.1 RNA 干扰技术11-16

1.1.1 RNAi 的发现11-12

1.1.2 RNA 干扰技术原理12-13

1.1.3 RNAi 作用的特点13-14

1.1.4 RNAi 技术在植物研究中的应用14-16

1.2 植物转录因子16-20

1.2.1 转录因子的结构17

1.2.2 DNA 结合区17

1.2.3 转录调控区17-18

1.2.4 与植物抗病反应有关的转录因子18-20

1.3 SBP 转录因子的研究进展20-22

1.3.1 SBP 转录因子的发现20-21

1.3.2 SBP 家族的功能21-22

1.4 本研究目的意义22-23

第二章 材料和方法23-31

2.1 材料23-24

2.1.1 植物材料23

2.1.2 质粒和菌株23

2.1.3 酶和主要试剂23

2.1.4 主要仪器设备23

2.1.5 常用抗生素贮存液23-24

2.1.6 培养基及缓冲液24

2.2 方法24-31

2.2.1 中国野生葡萄SBP 转录因子RNAi 载体的构建24-28

2.2.2 冻融法导入农杆菌28-29

2.2.3 转基因植株的获得及初步筛选29-30

2.2.4 SBP 转录因子功能分析30-31

第三章 结果和分析31-39

3.1 中国野生葡萄SBP 转录因子RNAI 载体构建31-37

3.1.1 SBP 转录因子cDNA 片段的扩增31

3.1.2 入门克隆载体pENTR~(TM)/D-SBP 的构建及PCR 鉴定31-35

3.1.3 植物干扰表达载体pHellsgate8-SBPb/f 的PCR 和酶切鉴定35

3.1.4 农杆菌EHA105 转化pHellsgate8-SBP 后的PCR 鉴定35-37

3.2 转基因植株的获得及初步筛选37

3.2.1 抗卡那霉素(kan)转基因植株的获得37

3.2.2 转基因拟南芥的PCR 检测37

3.3 SBP 转录因子功能分析37-39

第四章 讨论39-41

4.1 花序浸润法转化拟南芥应注意的问题39

4.2 LR 反应中出现的问题39-40

4.3 关于SBP 转录因子功能40-41

第五章 结论41-42

参考文献42-48

致谢48-49

作者简介49

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本文编号：153463