旋毛虫不同发育期抗原基因克隆及其对猪的保护作用研究

发布时间：2018-03-01 02:00

本文关键词： 旋毛虫猪重组蛋白体液免疫细胞免疫巨噬细胞中性粒细胞　出处：《吉林大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：旋毛虫是一种雌雄异体的线虫,可感染所有的哺乳动物(包括人类)、一些食肉鸟类和爬行动物。猪是旋毛虫感染的最重要的宿主之一,人感染旋毛虫的报道中很大比例是由于患者曾食用了感染有旋毛虫肌幼虫的生的或未完全熟的猪肉制品。因此,预防猪感染旋毛虫意义重大。本实验室前期实验中利用感染旋毛虫26天和60天的猪血清分别筛选旋毛虫不同发育时期的cDNA文库,得到了多条强反应原性的抗原基因,并初步研究了这些基因在小鼠旋毛虫感染模型中的免疫保护性。本实验根据上述研究结果选取了5条(Ts-zh68、Ts-clp、Ts-T668、Ts-serpin和Ts-p45)在小鼠模型中表现出抗旋毛虫保护性且疑似参与旋毛虫存活、寄生或免疫逃避的重要功能基因,另选取Ts-p43和Ts-p53这两条被报道在小鼠旋毛虫感染模型中保护性效果突出的基因,利用长白猪作为动物模型,开展这七条抗原基因对猪的免疫保护作用的研究。从而为旋毛虫疫苗的开发筛选高效的候选抗原和提供有价值的数据。本实验利用大肠杆菌原核表达系统分别诱导表达带有His标签的上述七种重组蛋白,利用镍柱进行亲和层析纯化,之后经大型垂直板SDS-PAGE电泳分离、切胶回收目的条带,用PBS溶出胶粒中的目的蛋白,最后对蛋白进行超滤管浓缩,经SDS-PAGE电泳鉴定得到高纯度的目的蛋白。七种目的蛋白纯化产物分别与旋毛虫感染60天猪血清进行免疫印迹实验,确认了它们的反应原性。佐剂的筛选对于重组蛋白疫苗的研发十分关键,弗氏佐剂是实验研究中应用最广泛的佐剂,但由于其本身的毒性以及对肉制品品质的影响,限制其在动物疫苗中的临床应用。一些新型疫苗佐剂在以旋毛虫感染小鼠为模型的疫苗研究中表现突出,但鉴于这些研究中所使用抗原的多样性,无法确定最佳佐剂。因此,本研究中以rTs-Serpin为代表性重组抗原,比较了三种不同类型的佐剂(Montanide ISA201,Montanide IMS 1313 N PR VG和弗氏完全及不完全佐剂)在以旋毛虫感染小鼠为模型的疫苗研究中的表现,具体包括评估佐剂促进体液免疫应答和细胞免疫应答的能力。佐剂筛选实验结果显示,与其他两种佐剂添加组相比,ims1313佐剂添加后的疫苗能够诱导最好的和最持久的igg抗体,诱导igm的最高峰值要比其他两种佐剂添加组提前两周出现,此外,ims1313佐剂添加组诱导小鼠血清中产生高水平的th1和th2型细胞因子。总之,结合有免疫刺激复合物的水分散性的液态纳米颗粒佐剂montanideims1313nprvg,展现出与弗氏佐剂相当的保护性和优于弗氏佐剂的免疫增强效果,是旋毛虫疫苗研究可选用的理想的佐剂。且该佐剂具有无需乳化、使用方法简便等优点。因此,montanideims1313nprvg被选用为后续研究中的佐剂。本研究中以长白猪为实验动物评估以上七种重组蛋白抗旋毛虫感染的保护性。实验共分为10个组,七个重组蛋白组、pbs组、pbs+ims1313佐剂组以及空白猪对照组,每组6头两月龄长白仔猪。共进行两次免疫接种,间隔4周,每头猪每次接种1mg重组蛋白,二免3周后各实验组(除空白猪对照组)均灌胃感染旋毛虫肌幼虫(t.spiralis),每头感染5000条肌幼虫。攻虫感染六周后处死实验动物,每头猪分别采集15个部位的肌肉,每个部位肌肉采集50g,最低不少于5g,用于消化收取旋毛虫肌幼虫,计算各实验组的平均lpg(每克肌肉中的幼虫数),以及比较各实验组相对于pbs对照组的肌幼虫减虫率。实验结果显示,以上七种重组蛋白在旋毛虫猪感染模型中保护性与在小鼠感染模型中存在很大差异。rts-t668、rts-clp、rts-zh68、rts-serpin、rts-p45、rts-p43和rts-p53在旋毛虫猪感染模型中表现出的肌幼虫减虫率分别为51.31%、31.03%、45.21%、4.79%、3.66%、38.92%和2.39%。实验中表现出保护力的四种蛋白中,肌幼虫减虫率超过40%的两种蛋白分别来源于旋毛虫成虫期和新生幼虫期,均为旋毛虫发育早期,这提示旋毛虫发育早期的关键蛋白质分子可作为较好的旋毛虫疫苗候选抗原。此外,研究中还采集所有实验动物膈肌,经甲醛固定、石蜡包埋、切片后进行he染色,观察和比较各实验组膈肌中旋毛虫包囊形态变化,结果发现各重组蛋白免疫组的膈肌旋毛虫包囊出现不同程度的形态变化,包囊周围炎细胞侵润的强度也存在差异,而pbs+ims1313组的旋毛虫包囊形态和周围炎细胞侵润情况与pbs组相比无明显差异。rts-t668和rts-clp组中观察到部分旋毛虫包囊形态变得相对其他各组更圆润,胶原层结构无明显变化;rts-zh68、rts-p45、rts-p53和rTs-p43中旋毛虫包囊的胶原囊不同程度的出现边缘不整齐或胶原层变薄;而rTs-serpin组旋毛虫包囊形态完整,无明显变化。此外,rTs-zh68、rTs-T668和rTs-p43组旋毛虫包囊周围炎细胞侵润相对剧烈,提示这些组中旋毛虫的胶原囊受损情况较严重。而rTs-clp、rTs-serpin、rTs-p45和rTs-p53组旋毛虫包囊周围炎细胞侵润情况较轻微。为了深入理解重组蛋白的免疫保护作用,评价这七种重组蛋白抗原诱导实验动物产生针对旋毛虫的保护性免疫应答的能力。本研究评估了各实验组重组蛋白免疫接种后体液免疫和细胞免疫应答的情况,具体包括血清中相应蛋白特异性IgG、IgG1、IgG2和IgM抗体水平变化趋势,Th1(IFN-γ、IL-2)和Th2(IL-10、IL-4)型细胞因子水平变化,以及二免两周后T、B淋巴细胞变化情况,旋毛虫感染后第六天天然免疫细胞(巨噬细胞和中性粒细胞)的变化情况。结果显示重组蛋白rTs-T668、rTs-clp和rTs-zh68免疫后均能使实验动物在感染旋毛虫后始终或者某一段时期内处于Th1型免疫应答占优势的Th1/Th2混合免疫应答状态。各重组蛋白组二免后两周均能诱导Th1(IFN-γ、IL-2)和Th2(IL-10、IL-4)型细胞因子水平显著升高(p0.05)。重组蛋白rTs-clp和rTs-p43免疫组与PBS对照组相比,巨噬细胞水平显著升高(p0.05),均能够消除旋毛虫感染后(Ad6)对巨噬细胞的抑制作用。与未感染旋毛虫的空白对照组相比,在感染旋毛虫后(Ad6),PBS组、佐剂+PBS组、rTs-p45组和rTs-p53组中性粒细胞水平显著下降(p0.05),这说明旋毛虫对中性粒细胞存在显著的免疫抑制作用,而rTs-clp和rTs-p43两组在感染旋毛虫后(Ad6)诱导了中性粒细胞水平略升高,虽不显著,但提示这两组中旋毛虫对中性粒细胞的抑制作用被消除。综合保护性实验和保护性免疫应答能力评估结果,推测重组蛋白诱导产生的抗旋毛虫保护性效果可能与多个保护性免疫应答因素有关,诱导Th1型占优势的Th1/Th2混合免疫应答,同时促进维持正常水平的天然免疫应答能力,可能是预防猪感染旋毛虫的免疫应答的关键。
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【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S852.7

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