自噬相关蛋白及基因LC3-Ⅱ、P62在儿童急性白血病中的表达及临床意义

发布时间：2018-03-02 03:30

本文关键词： 细胞自噬儿童急性白血病 LC3-Ⅱ P62 免疫组织化学 RT-PCR　出处：《河北医科大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的:细胞自噬是所有真核生物共有的一种保守的代谢途径,微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)及自噬降解底物P62蛋白在细胞自噬过程中起重要作用,本实验通过检测LC3-Ⅱ及P62蛋白及基因在初诊未治急性白血病儿童骨髓细胞中的表达程度了解急性白血病儿童骨髓细胞中细胞自噬的表达水平的高低,为从新的角度解释儿童急性白血病的发病机制提供依据,为儿童急性白血病的治疗提供新思路。方法:1免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法(Immunohistochemical streptavidin Perosidase)1.1病例及分组随机选取2014年1月至2016年6月在河北医科大学第二医院儿科住院确诊的初诊未治急性白血病(acute leukemia,AL)患儿50例作为实验组,其中急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)30例,包括标危13例,中危14例,高危3例,B型ALL24例,T型ALL6例;急性髓细胞性白血病(acute myelocytic leukemia,AML)20例,其中包括M1 1例,M2 5例,M3 5例,M4 4例,M5 3例,M7 2例;所有AL病例中性别组成为男孩30例,女孩20例,年龄1岁~14岁;所有患儿均经临床表现、细胞形态学(Morphology,M)、免疫学(Immunology,I)、细胞遗传学(Cytogentics,C)和分子生物学(Molecular,M)分型(MICM)确诊,同时随机选取性别和年龄与实验组相匹配的非恶性血液病患儿20例(其中包括免疫性血小板减少症患儿14例,营养性贫血患儿6例)作为对照组。1.2标本采集及处理分别抽取实验组及对照组患儿骨髓液2ml,放入玻璃管中自然凝固,凝固后倒入含有4%多聚甲醛的玻璃瓶中保存备用。之后石蜡包埋,将蜡块取4um厚连续切片,HE染色观察每个标本中白血病细胞数约占有核细胞总数的50%至95%,标本合格,行免疫组织化学法检测LC3-Ⅱ及P62蛋白的表达水平。切片采用盲法由研究者阅片。LC3-Ⅱ与P62蛋白均参照Fromowitz阳性细胞半定量分级法的判断方法,随机选取5个高倍视野(×400),每个视野细胞数不少于100个,细胞数过少的可选取10个高倍视野(×400),计数白血病细胞总数及白血病阳性细胞数,细胞浆或者细胞核里出现棕黄色颗粒为阳性。根据切片中阳性细胞占总细胞数的比率和染色深度分别进行评估。2逆转录聚合酶链式反应法(reverse transcription-PCR,RT-PCR)另选取2014年1月至2015年5月经上述方法确诊的初诊未治急性白血病患儿20例作为实验组,其中ALL患儿12例,AML患儿8例,及同期非恶性血液病患儿12例(包括免疫性血小板减少症患儿7例,营养性贫血患儿5例)作为对照组,分别抽取骨髓液0.5ml行RT-PCR检测LC3-Ⅱ及P62的m RNA表达水平。标本经过RNA的提取、逆转录、聚合酶链式反应等步骤电泳后经紫外灯检测。3统计学方法免疫组化资料采用SPSS21.0进行统计学分析,各组间LC3-Ⅱ和P62蛋白阳性率的比较采用χ2检验,LC3-Ⅱ和P62蛋白间的相关性采用spearman相关分析,检验水准α=0.05,P0.05为差异具有统计学意义。RT-PCR实验资料采用Graphpad prism 5.0,实验组与对照组之间的比较采用两样本t检验。结果:1免疫组化法:LC3-Ⅱ蛋白和P62蛋白阳性染色为棕色至棕褐色颗粒,LC3-Ⅱ位于细胞浆及部分细胞核中,P62位于细胞浆中。1.1 LC3-Ⅱ蛋白在实验组及对照组儿童中阳性表达率分别为66.00%(33/50)及15.00%(3/20),其差异具有统计学意义(P0.05);P62蛋白在实验组及对照组儿童中阳性表达率分别为76.00%(38/50)及55.00%(11/20),其差异不具有统计学意义(P0.05)。1.2 LC3-Ⅱ蛋白在ALL儿童及对照组儿童中阳性表达率分别为63.33%(19/30)及15.00%(3/20),其差异具有统计学意义(P0.05);P62蛋白在ALL儿童及对照组中阳性表达率分别为73.33%(22/30)及55.00%(11/20),其差异不具有统计学意义(P0.05)。1.3 LC3-Ⅱ蛋白在AML儿童及对照组儿童中阳性表达率分别为70.00%(14/20)及15.00%(3/20),其差异具有统计学意义(P0.05);P62蛋白在AML儿童及对照组儿童中阳性表达率分别为80.00%(16/20)及55.00%(3/20),其差异不具有统计学意义(P0.05)。1.4 LC3-Ⅱ蛋白在ALL儿童及AML儿童中阳性表达率分别为63.33%(19/30)及70.00%(14/20);P62蛋白在ALL儿童及AML儿童中阳性表达率分别为73.33%(22/30)及80.00%(16/20),其差异均不具有统计学意义(P0.05)。1.5 LC3-Ⅱ蛋白在男性AL、ALL及AML儿童中阳性表达率分别为66.67%(20/30)、60.00%(12/20)及80.00%(8/10),LC3-Ⅱ蛋白在女性AL、ALL、AML儿童中阳性表达率分别为65.00%(13/20)、70.00%(7/10)、60.00%(6/10),在AL儿童中、ALL儿童中及在AML儿童中,男性与女性LC3-Ⅱ蛋白阳性表达率的差异均不具有统计学意义(P0.05);P62蛋白在男性AL、ALL及AML儿童中阳性表达率分别为80.00%(24/30)、75.00%(15/20)、90.00%(9/10),P62蛋白在女性AL、ALL、AML儿童中阳性表达率分别为70.00%(14/20)、70.00%(7/10)、70.00%(7/10),在AL儿童中、ALL儿童中及在AML儿童中,男性与女性P62阳性表达率的差异均不具有统计学意义(P0.05)。1.6 LC3-Ⅱ蛋白在B型及T型ALL儿童中阳性表达率分别为66.67%(16/24)及50.00%(3/6),其差异不具有统计学意义(P0.05);P62蛋白在B型及T型ALL儿童中阳性表达率分别为75.00%(18/24)及66.67%(4/6),其差异不具有统计学意义(P0.05)。1.7经spearman相关性分析,AL儿童中LC3-Ⅱ与P62蛋白的表达水平无明显相关性(rs=0.249,P=0.103,P0.05)。2 RT-PCR检测结果:LC3-Ⅱ基因在实验组及对照组中的表达均呈正太分布,实验组中均数±标准差为0.360±0.047,对照组中均数±标准差为1.107±0.136,两样本比较t=5.169,P=0.000,P0.05,差异具有统计学意义;P62在两组数据中的表达均呈正太分布,实验组中均数±标准差为1.336±0.139,对照组中均数±标准差为1.610±0.449,两样本比较t=0.583,P=0.570,P0.05,差异不具有统计学意义。结论:1自噬相关基因及蛋白LC3-Ⅱ在急性白血病中表达上调,提示急性白血病儿童骨髓细胞中细胞自噬的表达水平升高,这可能与白血病发病有关。2 LC3-Ⅱ及P62蛋白在AML与ALL和男性与女性儿童AL中表达水平的比较,差异均无统计学意义;在B型及T型ALL儿童中的阳性率的比较差异无统计学意义;提示细胞自噬表达水平的高低可能与儿童急性白血病的种类、性别及ALL的免疫表型均无明显关系。3 Spearman相关性分析显示,AL儿童中LC3-Ⅱ与P62蛋白的表达可能无明显相关性。
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【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R733.71

【参考文献】