鸟分枝杆菌PhoP功能分析及其基因突变株的构建

发布时间：2018-03-02 11:39

  本文选题：鸟分枝杆菌　切入点：PhoP　出处：《微生物学通报》2016年09期 　论文类型：期刊论文

【摘要】：【目的】对鸟分枝杆菌PhoP的功能进行分析及构建PhoP基因突变株,为深入研究PhoP的调控机制打下基础。【方法】利用PCR扩增出鸟分枝杆菌PhoP DNA结合区(PhoPC)编码序列,与表达载体p GEX-4T-3连接后,转化入大肠杆菌BL21(DE3)中表达GST-PhoPC融合蛋白。用凝血酶去除GST标签,制备PhoPC蛋白;利用PCR扩增出鸟分枝杆菌PhoP基因及其下游基因MAV0127、PhoU和Amt的启动子片段,采用凝胶迁移率移动试验(EMSA)分别检测PhoPC与PhoP、MAV0127、PhoU和Amt的启动子结合的情况。通过PCR扩增PhoP基因上、下游片段,构建PhoP基因缺失性同源核苷酸片段,与自杀质粒p GMB151连接后,通过电转化导入鸟分枝杆菌进行同源交换,利用PCR筛选出PhoP基因缺失突变株。【结果】EMSA结果显示,鸟分枝杆菌PhoP能与PhoP、MAV0127及Amt基因启动子结合,不能与PhoU结合。通过PCR和序列分析证实基因突变株的PhoP基因缺失了309个碱基。【结论】PhoP不仅可调控其下游基因MAV0127和Amt的转录水平,还可调控其自身基因的转录,但不参与调节PhoU二元调控系统。构建了PhoP基因缺失突变株,为进一步研究其在鸟分枝杆菌的调控功能奠定了基础。
[Abstract]:[objective] to analyze the function of Mycobacterium avium PhoP and construct the mutant of PhoP gene so as to lay a foundation for further study on the regulatory mechanism of PhoP. [methods] the coding sequence of PhoP DNA binding region of Mycobacterium birdis was amplified by PCR. After ligation with expression vector p GEX-4T-3, GST-PhoPC fusion protein was expressed in Escherichia coli BL21 (DE3). The PhoPC protein was prepared by removing GST tag by thrombin, and the promoter fragments of PhoP gene and its downstream gene MAV0127 PhoU and Amt were amplified by PCR. Gel mobility shift assay (EMSA) was used to detect the binding of PhoPC to the promoter of PhoPMAV0127 Phou and Amt. The upstream and downstream fragments of PhoP gene were amplified by PCR, and the homologous nucleotide fragment of PhoP gene was constructed, and the homologous nucleotide fragment of PhoP gene was ligated with suicide plasmid p GMB151. The deletion mutant of PhoP gene was screened by PCR. [results] EMSA results showed that PhoP could bind to the promoter of PHOPMAV0127 and Amt gene. It is proved by PCR and sequence analysis that the PhoP gene of the mutant lacks 309 bases. [conclusion] PhoP can not only regulate the transcription level of the downstream gene MAV0127 and Amt, but also regulate the transcription of its own gene. The mutant of PhoP gene deletion was constructed, which laid a foundation for further study of its regulatory function in Mycobacterium avium.
【作者单位】： 广西医科大学生物化学与分子生物学教研室广西高校生物分子医学研究重点实验室;

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