桥本氏甲状腺炎—甲状腺乳头状癌的免疫微环境及基因关联性初步研究

发布时间：2018-03-04 08:08

  本文选题：甲状腺癌　切入点：桥本氏甲状腺炎　出处：《昆明理工大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：甲状腺癌是一种内分泌系统极为常见的恶性肿瘤,而甲状腺乳头状癌(Papillary thyroid carcinoma,PTC)在全世界的发病率也表现为逐年上升的趋势,成为内分泌系统肿瘤的研究热点。桥本甲状腺炎(Hashimoto's thyroiditis,HT)是最多见的一种自身免疫性的甲状腺疾病。HT合并PTC(PTC/HT)的发病率不断上升,不少研究者认为HT是PTC的癌前病变,许多专家及学者对此观点给出了印证,且表示HT与PTC之间关系十分紧密。但也不乏研究者认为它们两者的共存是一种偶然。至于到底是哪些因子参与了 HT-PTC的演化过程以及它们参与发病的具体机制和细节,现在还未明确。有研究发现浸润在PTC肿瘤微环境中的肿瘤浸润淋巴细胞主要是CD4+T辅助细胞(Th),它是一种具有高度异质性和可塑性的细胞亚型,作为高效细胞免疫应答的协调中心,它在肿瘤免疫过程中起着至关重要的作用。初始CD4+T(Th0)细胞在与病原体相关分子或损伤相关分子相互作用后,接收不同的信号刺激可分化成至少四种功能不同的亚群细胞,如Th1,Th2,Th17和Treg。本课题通过对云南高原地区PTC的病例回顾性分析,寻找云南高原人群PTC的危险因素,发现HT与PTC的发生密切相关,继而从PTC肿瘤微环境中浸润的Th17和Treg细胞的角度,探讨Treg细胞和Th17细胞在HT-PTC的演变过程中的作用;运用基因表达谱芯片技术分析HT-PTC演变过程中免疫相关基因的变化趋势及关联;探讨肿瘤免疫微环境在HT-PTC发生发展中的作用以及对PTC合并HT患者预后的影响。本文的主要研究结果如下:(1)本课题收集云南省第一人民医院2003年1月至2012年12月收治的PTC患者578例及良性甲状腺结节患者620例,采用病例对照研究的方法,从病理类型和临床资料等多个角度首次研究云南高原地区的PTC危险因素,并且选取中国不同海拔地区具有突出代表性的文章进行回顾分析。单因素回归分析表明,云南高原地区PTC患者的平均年龄与甲状腺良性肿瘤患者相比较小;PTC患者术前的TSH水平比良性结节组较高;PTC患者的甲状腺素受体抗体(TRAb)、甲状腺过氧化物酶抗体(TPOAb)和甲状腺球蛋白抗体(TGAb)的阳性比率比良性组较高;PTC患者合并桥本甲状腺炎(HT)(12.1%)或淋巴细胞性甲状腺炎(LT)(5.6%)的比率高于良性结节组;PTC患者初潮年龄≤13岁、孕育子女数≤2个及未绝经的比率明显高于良性结节组;提示患者的年龄大小、术前血清的TSH情况、月经生育史、自身免疫性疾病及相应抗体都很可能与云南高原地区PTC的产生有着一定的相关性。多因素回归分析显示,年龄45 岁(OR=0.114,P0.001),肿瘤直径1 cm(OR=0.371,P=0.003),TG水平异常升高(OR=0.481,P=0.01)是PTC的保护性因素。异常升高的TGAb(OR=4.894,P0.001)和 TRAb 水平(OR=16.047,P0.001)是云南高原地区 PTC的独立危险因素,提示HT及其自身免疫性抗体TGAb和TRAb与云南高原地区PTC的发生密切相关。(2)为研究高原儿童及青少年PTC发生发展的危险因素,我们联合云南省第一人民医院及云南省肿瘤医院近十一年的儿童及青少年PTC患者的临床资料,单因素回归分析发现,在云南高原地区84例诊断为PTC的儿童和青少年中,13例经组织病理学证实为HT(15.5%)。异常升高的术前TSH水平、TPOAb、合并HT与云南高原儿童和青少年PTC的发生发展相关。多因素回顾分析结果表明,肿瘤直径(1cm)(OR=0.344,P0.01)是云南高原儿童及青少年PTC的独立保护性因素,异常升高的TGAb水平(OR=25.924,P0.01)是独立危险因素。因此,我们认为桥本氏甲状腺炎与云南高原地区的成人和儿童青少年甲状腺乳头状癌的发生密切相关,桥本氏甲状腺炎患者需定期随访;对TGAb和TRAb水平异常升高的患者更需要特别关注。(3)通过对PTC合并或不合并HT患者术后石蜡包埋组织的免疫组化研究,我们观察到PTC患者RORγt低表达组有淋巴结转移的比率明显高于高表达组的患者(71.4%vs.33.3%,P=0.017),表明PTC肿瘤微环境中RORyt的表达与淋巴结转移具有一定的相关性。PTC/HT患者Foxp3高表达组有淋巴结转移的比率明显比低表达组的患者高(68.2%vs.37.5%,P=0.037),RORyt低表达组有淋巴结转移患者的比率明显比高表达组的患者高(69.2%vs.30.0%,P=0.008);说明PTC合并HT肿瘤微环境中Foxp3及RORyt的表达与淋巴结转移均具有相关性。经Spearson的相关性分析后,发现以上两组患者RORyt与淋巴结转移都有负相关关系(P=0.024,P=0.046)。PTC合并或不合并患者RORyt的表达与TPOAb均呈负相关(P=0.027)。通过RT-PCR法研究PTC合并HT或不合并HT患者癌组织Foxp3和RORγt的mRNA表达,我们发现PTC患者癌组织中Foxp3 mRNA表达水平高于PTC/HT患者,但差异无统计学意义(t=1.75,P=0.224)。PTC/HT患者RORγtmRNA表达水平高于PTC患者,差异有统计学意义(t=2.62,P=0.011),提示RORyt在HT合并PTC的发生发展中可能通过削弱TPOAb的作用而发挥抑制肿瘤淋巴结转移的功能。(4)为评估肿瘤微环境中PTC癌细胞对初始T淋巴细胞的诱导分化影响,本研究运用Transwell小室将脐带血初始T淋巴细胞与人PTC细胞株(TPC-1或K1)共培养后,与正常甲状腺滤泡上皮细胞系(nthy ori 3-1)作对照后发现,①PTC细胞株对人初始T细胞分化成Foxp3+Treg细胞和RORγt+Th17细胞均具有积极作用。脐带血初始T细胞在这个过程中对TPC-1和K1有高度的响应,而对正常对照的nthy ori 3-1则表现为低反应。②PTC细胞株与脐带血初始T细胞共作用后,诱导分化出的Th17细胞和Treg细胞呈波动式增长。至36h时,诱导分化出的CD3+CD8-IL-17+Th17细胞和CD4+CD25+CD127-Treg细胞比例最高,形成的Th17/Treg细胞比大于1,且比正常对照组高,Th17/Treg平衡显然偏向Th17方向,因此我们推测Th17细胞的占比大使得PTC预后较好。③K1为伴淋巴结转移的PTC细胞系,经K1诱导的初始T淋巴细胞形成的Th17/Treg细胞比也高于不伴有淋巴结转移的TPC-1癌细胞系,提示Th17和Treg细胞的数量变化可能与PTC的淋巴结转移相关。以上结果表明PTC可诱导初始T淋巴细胞分化成为Treg和Th17两类CD4+T辅助淋巴细胞,且Th17细胞比例大于Treg细胞,推测可能是PTC合并HT患者预后较好的原因。(5)为探究趋化因子和细胞因子在HT-PTC演变过程中的表达和意义,我们采用流式细胞术的微球阵列(cytometric bead array,CBA)技术检测HT、PTC合并HT或不合并患者术前外周血血清Th1(TNF-α、IL-2、IFN-γ),Th2(IL-4、IL-6、IL-10)及Th17(IL-17)细胞因子和趋化因子(IP-10、MIG、IL-8、RANTES、MCP-1)的表达水平,并与良性甲状腺肿瘤患者作对照,我们观察到:①PTC合并HT或不合并HT患者均存在免疫平衡紊乱。运用IFN-γ/IL-4的比值来代表Th1/Th2的比值,发现PTC患者Th1/Th2比值为0.84±0.19,与良性肿瘤对照组相比明显降低,免疫向Th2方向偏移,表明抗肿瘤免疫被抑制。而PTC/HT患者的Th1/Th2比值为0.88±0.13,明显较良性肿瘤对照组低,免疫也偏向Th2方向,但是PTC/HT患者Th1/Th2比值比PTC患者略高,即使没有统计学意义,也预示合并HT的PTC患者抗肿瘤免疫水平比不合并HT的PTC患者可能较好。②本研究还发现IP-10和MIG可能协同在PTC合并HT患者中将TIL从区域淋巴结淋巴肿瘤至肿瘤组织,发挥抗肿瘤免疫的作用。(6)采用Illumina基因表达谱芯片和实时荧光定量PCR(RT-PCR)方法探究HT-PTC演变过程中差异表达的基因。PCA主成分分析显示6例PTC患者的癌组织、4例PTC/HT患者的癌组织及4例病理证实的HT组织分属于三个不同的区域,样本间有较远的空间距离,是三类完全不同的组织;MultiClassDif差异基因筛选表明,三组比较差异表达基因共1257个,其中功能明确的有945个,功能不明确的有312个;有45项显著性信号通路(Pathway)和290项显著性功能(Go)参与HT-PTC的演变;选择与免疫相关的20项GO及11项Pathway,取交集后,共有与免疫相关的120个差异基因纳入研究,与免疫关联的16项趋势中有六项趋势表现出统计学意义,我们选择10个与免疫相关的基因进行后续的生物信息学分析及qPCR验证,符合趋势的共有 7 个基因 ADRBK1、PTPN6、CD247、TNFSF13B、CXCL9、TNFRSF14、CAV1,功能主要集中在T细胞和B细胞免疫调节的通路方面,尚需下一步功能实验逐一验证。
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【学位授予单位】：昆明理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R581.4;R736.1
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本文编号：1564819