河南华溪蟹生殖调控基因vasa的克隆和原核表达

发布时间：2018-03-08 00:36

  本文选题：河南华溪蟹　切入点：vasa基因　出处：《山西大学》2016年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：vasa基因编码一种ATP依赖的RNA解旋酶,属于DEAD-box家族,最先在果蝇(Drosophila)中被发现。vasa基因在生殖细胞中特异表达,在动物生殖细胞发生和生殖调控中发挥着重要作用,被用作生殖细胞的分子标记物,主要用于配子发生和原生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)的起源、迁移和分化等方面的研究。本文通过RACE技术克隆得到了河南华溪蟹(Sinopotamon henanense)vasa基因cDNA序列,证实了vasa基因仅在生殖细胞中特异表达;构建了河南华溪蟹VASA蛋白原核表达载体Vexp-28a、Vexp-32a、Ve-28a及Ve-32a,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行了原核表达。本文克隆得到的河南华溪蟹vasa基因cDNA序列长2896bp,其中编码区长1329bp,编码442个氨基酸的蛋白。Blast比对结果表明由该cDNA序列推测翻译的蛋白氨基酸序列与鱼类、两栖类、鸟类、哺乳类以及一些无脊椎动物的VASA蛋白氨基酸序列有较高的相似性;结构域分析也表明该氨基酸序列具有DEAD-box家族共有的4个保守motif(motifⅠ、motifⅠa、motifⅠb、motifⅡ)、一个锌指结构和GG重复序列,还具有VASA亚家族基因专一性特征结构,如Q-motif、RGG重复序列和甘氨酸富集区,与DEAD-box家族蛋白具有的8个保守结构域motifⅠ、motifⅠa、motifⅠb、motifⅡ、motifⅢ、motifⅣ、motifⅤ、motifⅥ以及两个锌指结构、一个Q-motif,GG重复的结构相比,本文获得的蛋白氨基酸序列在motifⅡ之前(包括motifⅡ)的序列是正确的,但在motifⅡ之后的序列中,由于一些原因使蛋白翻译提前终止,因此,我们所得到的Sh-vasa基因cDNA序列的3'端还待进一步验证;多序列比对和系统进化分析显示该cDNA序列编码的氨基酸序列与其它虾蟹类的VASA蛋白进化关系最近。以上结果均表明,本文所获得的cDNA序列确定为河南华溪蟹vasa基因5'端及部分编码区cDNA序列。通过半定量PCR(Sq-PCR)监测河南华溪蟹vasa基因在不同组织中的表达情况,结果显示,vasa基因在河南华溪蟹体内仅在生殖细胞中特异表达。以得到的河南华溪蟹vasa基因cDNA序列为基础,设计两对引物,通过PCR,在选定的vasa基因片段两端加上EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点,然后利用基因重组技术将获得的vasa基因表达片段分别克隆至pET-28a、pET-32a原核表达载体,经酶切鉴定和测序,成功构建河南华溪蟹VASA蛋白原核表达载体Vexp-28a、Vexp-32a、Ve-28a及Ve-32a,并通过IPTG诱导进行原核表达,蛋白上清和包涵体沉淀分别经过His·Tag亲和层析柱分离、纯化,通过SDS-PAGE分析以及Western blot鉴定,所得蛋白并非河南华溪蟹VASA融合蛋白,需在河南华溪蟹vasa基因cDNA序列内重新选取表达片段,或重新选择表达载体,改进实验方案,再次实验,以期获得河南华溪蟹VASA融合蛋白。
[Abstract]:Vasa gene encodes a ATP dependent RNA helicase, belonging to the DEAD-box family. It was first found in Drosophila melanogaster that the RNA ASA gene is specifically expressed in germ cells and plays an important role in the genesis and reproductive regulation of animal germ cells. It is used as a molecular marker of germ cells, mainly used in the study of gametogenesis and the origin, migration and differentiation of primordial germ cells. The cDNA sequence of Sinopotamon henanense)vasa gene was cloned by RACE technique. It was confirmed that vasa gene was expressed only in germ cells. The prokaryotic expression vectors of Vexp-28a- Vexp-32aHe-28a and Ve-32a were constructed and expressed in E. coli BL21DE3. The cDNA sequence of vasa gene of Huaxi crab in Henan Province was 2896bp, in which the coding region was 1329bp, encoding 442 amino acids. The results of protein. Blast alignment showed that the translated amino acid sequence of protein and fish were deduced from the cDNA sequence. The amino acid sequences of VASA protein in amphibians, birds, mammals and some invertebrates are similar. Domain analysis also showed that the amino acid sequence had four conserved motif(motif 鈪，

本文编号：1581685