小鼠新基因Dnajc5b的克隆表达及Rcet1敲除后表型的检测研究

发布时间：2018-03-12 15:06

  本文选题：Dnajc5b　切入点：克隆　出处：《湖南理工学院》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：小鼠Dnajc5b和Rcet1基因是我们克隆的分别在小鼠睾丸和生殖域特异表达的新基因。Dnajc5b是DNAJ(HSP40)的同源物,亚家族C,成员5中的第二个,故命名Dnajc5b,该基因位于小鼠第三号染色体,含五个外显子,总长度为947bp,开放阅读框为597bp,共编码199个氨基酸。通过多组织RT-PCR检测,Dnajc5b在小鼠睾丸组织中特异表达;小鼠睾丸不同时期RT-PCR检测出,Dnajc5b在小鼠出身后第一周、第二周弱表达,第三周开始表达增强,第八周性成熟时表达最大。同时,原位杂交结果表明,Dnajc5b基因在小鼠精原细胞中特异表达。pEGFP-C3/Dnajc5b转染实验表明Dnajc5b蛋白在细胞质中表达。Dnajc5b原核表达得到了25KD左右的融合蛋白,利用His抗体通过Western Blot检测正确;同时对Dnajc5b融合蛋白进行分离纯化,得到纯化后的Dnajc5b蛋白,经6his抗体检测正确。通过点突变内含子和外显子之间的剪接位点gt和ag,致使内含子无法剪切而得不到成熟的mRNA,本实验室得到了敲除Rcet1的小鼠模型;检测结果表明:敲除Rcet1雄性小鼠完全不育;睾丸和附睾不能正常发育,睾丸萎缩,附睾囊肿;曲精小管中精母细胞核变大、出现多核细胞、精子严重不足;附睾管管腔变大、柱状细胞脱落、精子数量极少。Dnajc5b研究表明,Dnajc5b在睾丸组织中特异表达,其表达量与睾丸发育时期呈正相关;由于Dnajc5b含有Dnaj结构域和HSP40的结构位点,其亚细胞定位在细胞质中,Dnajc5b可能具有分子伴侣或热休克蛋白的功能。Rcet1敲除小鼠表明,缺乏Rcet1的小鼠睾丸和附睾不能正常发育,显示少精或者无精,表现为雄性不育。本文对Dnajc5b和Rcet1的研究结果,为进一步研究其生精过程中的分子机制打下了一定的基础。
[Abstract]:Mouse Dnajc5b and Rcet1 genes are the second in the subfamily C5, which is a novel gene specifically expressed in mouse testis and reproductive domain, respectively. Dnajc5b is located on chromosome 3 of mice. It contains five exons with a total length of 947 BP and an open reading frame of 597 BP, encoding 199 amino acids. The specific expression of Dnajc5b in mouse testis was detected by multitissue RT-PCR, and the first week after mouse testicular RT-PCR was detected by RT-PCR at different stages of mouse testis, the total length of Dnajc5b was 997 BP, and the total length of Dnajc5b was 597 BP. The expression was weak at the second week, increased at the third week, and reached the highest at the sexual maturity of 8th weeks. At the same time, The results of in situ hybridization showed that the specific expression of Dnajc5b gene in mouse spermatogonia. PEGFP-C3 / Dnajc5b transfection experiment showed that the Dnajc5b protein expressed in the cytoplasm and expressed in prokaryotic expression of about 25KD fusion protein, which was correctly detected by Western Blot using His antibody. At the same time, the Dnajc5b fusion protein was isolated and purified, and the purified Dnajc5b protein was obtained. By 6his antibody, the splicing sites between point mutation intron and exon were correct. The mouse model of knockout Rcet1 was obtained by using the splicing sites gt and ag. the intron could not be cut and could not be mature. The results showed that the male knockout Rcet1 mice were completely infertile; the testis and epididymis did not develop normally, the testis atrophy, and the epididymal cyst; the seminiferous nucleus became larger in the seminiferous tubule, the multinucleated cells appeared, and the sperm was severely deficient; the epididymal duct lumen became larger. The columnar cells shed, the sperm count was very few. Dnajc5b was expressed specifically in testis, and the expression of Dnajc5b was positively correlated with testicular development, because Dnajc5b contained the Dnaj domain and the structural site of HSP40. The subcellular localization of Dnajc5b in the cytoplasm may have the function of molecular chaperone or heat shock protein. Rcet1 knockout mice showed that the testis and epididymis of Rcet1 deficient mice could not develop normally, indicating oligozoospermia or azoospermia. The results of the study on Dnajc5b and Rcet1 lay a foundation for further study on the molecular mechanism of spermatogenesis.
【学位授予单位】：湖南理工学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q78

【参考文献】

相关期刊论文 前10条

1 熊利芝;吴玉先;曹卫君;何则强;;栝楼籽蛋白分离纯化及抗氧化性的研究[J];应用化工;2016年01期

2 熊利芝;吴玉先;王家坚;周双鹤;曹卫君;何则强;;栝楼籽蛋白质提取工艺优化及抗氧化性[J];精细化工;2014年12期

3 朱莉;刘刚;;小鼠生精相关基因pQE/Dnajb13重组载体的构建和蛋白表达[J];南方医科大学学报;2013年12期

4 张懿;刘刚;;大鼠生精相关基因TSARG1原核表达载体的构建和表达[J];实用预防医学;2011年08期

5 李玉山;冯晓霞;吉晓菲;王全先;高学敏;杨险峰;潘周辉;孙琳;马奎;;SEPT4蛋白在特发性弱精子症患者精子中的表达[J];中华男科学杂志;2011年08期

6 丁之德;;男性不育基础研究的现状及可能性途径[J];中国男科学杂志;2010年03期

7 周其赵;冯春琼;毛向明;;弱精子症相关基因与蛋白研究进展[J];中华男科学杂志;2009年09期

8 朱复希;刘刚;卢光t;;生精相关HSP40家族蛋白的研究进展[J];现代生物医学进展;2009年10期

9 张如新;聂东宋;;一个小鼠睾丸特异表达新基因mtIQ2的克隆和表达谱分析[J];生命科学研究;2008年02期

10 向阳;邹寿长;周延凯;周明乾;聂东宋;;生殖域中特异表达的新基因Rcet2的克隆[J];吉首大学学报(自然科学版);2008年03期

相关会议论文 前1条

1 唐炜;王志珍;;分子伴侣DnaJ的锌指结构和蛋白氧化还原酶性质[A];中国生物化学与分子生物学会第八届会员代表大会暨全国学术会议论文摘要集[C];2001年

相关博士学位论文 前1条

1 向阳;人类胚胎干细胞体外培养过程中Wnt基因在饲养层和人类胚胎干细胞中的差异表达及Wnt9a的RNAi研究；生精相关新基因Cymg1和Rcet1的克隆及初步功能研究[D];中南大学;2006年

相关硕士学位论文 前9条

1 刘亚芳;KIFC1高表达对非小细胞肺癌增殖及预后的影响[D];南方医科大学;2016年

2 朱莉;人类生精相关基因DNAJB13在精子运动中的功能和机制研究[D];中南大学;2014年

3 张文强;一种可视型分子筛体系的构建及亮氨酸拉链作为影响蛋白构象工具的初探[D];浙江师范大学;2014年

4 刘婷婷;人DNAJC25基因的克隆、鉴定及其初步功能探讨[D];复旦大学;2012年

5 邹金;电穿孔介导Kallistatin基因在体内的表达对NCI-H446皮下移植瘤的预防和治疗效果[D];华侨大学;2012年

6 杨耀飞;日本血吸虫组织蛋白酶B2在小鼠抗血吸虫再感染中的作用研究[D];南华大学;2011年

7 吴文韬;GAS41基因在斑马鱼胚胎早期发育过程中的功能研究[D];湖南师范大学;2010年

8 王花欣;弓形虫基因疫苗SAG1-MIC4免疫小鼠的实验研究[D];山东大学;2009年

9 李维娜;人类生精细胞凋亡相关新基因TSARG6与AR关系的初步研究[D];中南大学;2007年

，

本文编号：1602087