杜仲橡胶合成途径关键酶基因HMGR的功能研究

发布时间：2018-03-13 14:12

  本文选题：杜仲　切入点：3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶基因　出处：《中国林业科学研究院》2016年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：我国是世界上最大的天然橡胶消费国,而我国天然橡胶对外依存度却高达80%以上,已超国家战略安全警戒线。面对天然橡胶资源的短缺,新胶源物种的开发迫在眉睫。杜仲橡胶是极具发展潜力的优质天然橡胶资源,但因用于提取杜仲橡胶的原材料叶片和果实中橡胶产量相对较低,造成原料成本较高,严重制约着杜仲橡胶的产业化发展。而揭示杜仲橡胶生物合成过程中的基因调控机理有助于寻找提高杜仲橡胶产量的方法。本研究通过基因克隆、实时荧光定量PCR、亚细胞定位、过量表达及启动子克隆和活性验证等方法对EuHMGR基因的表达模式和功能进行了初步研究,并初步建立了杜仲组织培养体系,为揭示EuHMGR基因在杜仲橡胶生物合成过程中的分子作用机理奠定基础。主要结果如下:(1)克隆得到EuHMGR基因全长cDNA,并对其进行生物信息学分析。结果表明,EuHMGR基因ORF长1770 bp,编码590个氨基酸,相对分子质量为63 k Da,等电点为6.89;含有2个NADP(H)结合位点GTVGGGT、DAMGMNM及2个HMG-Co A结合位点TTEGCLVA、EMPVGYVQIP,且与已知植物HMGR基因序列相似性达80%以上。(2)分析了EuHMGR基因表达模式与杜仲橡胶合成的相关性。通过分析不同时期不同组织EuHMGR基因的表达模式发现,EuHMGR基因在杜仲果皮和叶片中均有表达,果皮中EuHMGR基因的表达量在幼果时期(4月至5月)达到最大值,而叶片中EuHMGR基因的表达量在7月中旬达到最大值。不同时期果皮和叶片中EuHMGR基因表达模式和含胶增长速率相关性分析显示,果皮中EuHMGR基因的表达模式变化规律与含胶增长速率变化规律在统计学水平呈显著正相关,而在叶片中两者无相关性。(3)确定了EuHMGR基因编码产物作用的位置。通过构建EuHMGR与YFP的融合表达载体,并在烟草中瞬时表达,分析EuHMGR的亚细胞定位。结果表明,EuHMGR定位在内质网上,与MVA途径位于细胞质中相符。(4)EuHMGR功能验证。通过构建过量表达载体35S::EuHMGR,农杆菌介导转化EuTIDS5转基因烟草,筛选得到阳性植株共28株,并对阳性株系的EuTIDS5表达量进行检测,发现EuTIDS5在过量表达EuHMGR烟草中的表达量有不同水平的提高,随后,对阳性株系异戊二烯含量进行测定,结果发现,过量表达植物的异戊二烯含量提高了4-13%,说明EuHMGR的过量表达有利于EuTIDS5基因的表达,从而提高反式异戊二烯的合成和积累。(5)克隆分析了EuHMGR基因的启动子并验证其启动子功能。克隆得到EuHMGR基因上游长2104 bp的片段,序列分析表明,EuHMGR基因启动子含有大量TATA box、CAAT box等保守转录元件,此外,还含有与发育、激素响应、非生物胁迫和生物胁迫等相关的顺式作用元件。构建植物表达载体p EuHMGR::GUS,在烟草中瞬时表达,结果表明,克隆得到的该序列能启动GUS报告基因的正常表达,说明其具有启动子功能。(6)以杜仲无菌苗下胚轴为外植体,初步构建了杜仲组织培养体系。研究发现以MS(无机盐)+B5(有机物)+30 g/L蔗糖+6.0 g/L琼脂为基本培养基,愈伤组织诱导培养基激素配方为:6-BA(1.0 mg/L)+NAA(1.0 mg/L);愈伤组织继代培养基激素配方为:6-BA(0.5 mg/L)+NAA(0.5 mg/L),愈伤组织诱导率达90%以上;分化培养基激素配方为:6-BA(1.0mg/L)+TDZ(1.0 mg/L)+NAA(0-0.15 mg/L),分化率在20%左右。生根培养基采用1/2MS+15 g/L蔗糖+6.0 g/L琼脂为基本培养基,并把切口端在300 mg/L的无菌ABT生根粉溶液中浸泡5s效果最佳。
[Abstract]:China is the world's largest natural rubber consumption in China, and our dependence on foreign natural rubber was as high as 80%, has exceeded the national strategic security cordon. Facing the shortage of natural rubber resources, the development of new rubber source species is imminent. Eucommia rubber is a great potential for the development of high-quality resources of natural rubber, but because of the production of rubber rubber raw materials used for extracting Eucommia leaves and fruits were relatively low, resulting in high cost of raw materials, seriously restricting the industrial development of Eucommia rubber. And reveal the mechanism of gene regulation in the biosynthesis process of Eucommia rubber helps to find ways to improve the yield of rubber of Eucommia ulmoides. In this study, through gene cloning, quantitative real-time PCR excess, subcellular localization, expression and promoter activity of cloning and verification of EuHMGR gene expression pattern and function were studied, and the preliminary establishment of Du Zhong organization Training system, lay the foundation for revealing the molecular mechanism of EuHMGR gene in the process of Eucommia rubber biosynthesis. The main results are as follows: (1) cloned the full-length cDNA of EuHMGR gene and its bioinformatics analysis. The results showed that the EuHMGR gene of ORF 1770 BP in length, encoding 590 amino acids. The relative molecular mass of 63 K Da, the isoelectric point was 6.89; with 2 NADP (H) GTVGGGT binding sites, DAMGMNM and 2 HMG-Co A binding sites TTEGCLVA, EMPVGYVQIP, and HMGR gene sequences of known plant similarity was more than 80%. (2) analysis of the EuHMGR gene expression pattern and the synthesis of Eucommia rubber. Through the analysis of the expression pattern of EuHMGR gene in different tissues showed that EuHMGR gene in the pericarp and leaves of Eucommia ulmoides were expressed, expression of EuHMGR gene in the pericarp in young fruit period (April to May) reached the maximum value, and in the leaves of EuHMGR gene The expression reached the maximum in the middle of July. The analysis mode and the growth rate showed a correlation with EuHMGR glue peel and leaf gene expression in different periods, the expression pattern of EuHMGR gene variation in the pericarp and gum growth rate changes in the level of statistics showed a significant positive correlation, both in leaves no correlation (3) to determine. The EuHMGR gene encoding product function position. The expression vector of fusion constructs of EuHMGR and YFP, and in tobacco transient expression, subcellular localization analysis of EuHMGR. The results showed that EuHMGR located in the endoplasmic reticulum in the cytoplasm, consistent with the MVA pathway in. (4) EuHMGR functional verification. Through the construction of over expression vector 35S:: EuHMGR Agrobacterium mediated transformation, transgenic tobacco EuTIDS5, screened positive plants were 28 strains, and the positive expression of EuTIDS5 strains were detected, the expression of EuHMGR EuTIDS5 in the amount found The expression of tobacco in different level, then the positive strains of isoprene content were measured, results showed that overexpression of isoprene content in plants increased by 4-13%, indicating that EuHMGR overexpression facilitates the expression of EuTIDS5 gene, so as to improve the synthesis and accumulation of trans isoprene. (5) cloning and analysis of EuHMGR the gene promoter and verify its promoter function. The cloned EuHMGR gene upstream 2104 BP long fragment sequence analysis showed that EuHMGR gene promoter contains a lot of TATA box, CAAT box and other conservative transcription element, in addition, also contain and growth hormone responses to abiotic and biotic stress related cis element. To construct plant expression vector EuHMGR:: P GUS, the expression of instantaneous in tobacco. The results show that the normal expression of GUS gene promoter report the sequence cloned, shows its promoter . (6) in Eucommia aseptic seedling hypocotyl as explants, initially constructed Eucommia tissue culture system. The MS (inorganic salt) +B5 (organic) +30 g/L sucrose +6.0 g/L agar medium as basic medium, hormone induction medium formula for callus: 6-BA (1 mg/L +NAA (1) mg/L); callus subculture medium hormone formula was: 6-BA (0.5 mg/L) +NAA (0.5 mg/L), the callus induction rate was above 90%; the differentiation medium hormone formula was: 6-BA (1.0mg/L) +TDZ (1 mg/L) +NAA (0-0.15 mg/L), the differentiation rate in culture medium with left and right 20%. 1/2MS+15 g/L sucrose +6.0 g/L agar medium and rooting, the cut ends in a sterile ABT 300 mg/L rooting powder solution for 5S effect best.

【学位授予单位】：中国林业科学研究院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S792.99

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 俞志成;;杜仲的价值与几种育苗技术[J];林业经济;2001年04期

2 张源润,王春燕,吴彩宁,夏红玲,王双贵,韩彩萍,梅曙光;杜仲育苗关键技术的探讨[J];干旱区资源与环境;2001年02期

3 王高峰,赵田生;杜仲高产优质栽培技术[J];农业科技与信息;2001年01期

4 俞志成;杜仲的价值与育苗技术[J];农村科技开发;2001年01期

5 俞志成;;杜仲的环剥与加工技术[J];农村科技开发;2002年07期

6 李平;杜仲的应用和栽培[J];新农业;2002年10期

7 卫世珍;杜仲的经济价值及育苗技术[J];山西林业;2004年02期

8 李玉燕;杜仲丰产栽培[J];安徽林业;2004年05期

9 汤诗杰;李和平;贺善安;;杜仲研究的现状与展望[J];林业科技开发;2007年02期

10 孙科才;王学安;王占海;孙景春;高广丰;崔连玉;;集安市杜仲引种实验研究[J];现代农业科学;2008年11期

相关会议论文 前10条

1 裴红宾;;不同用途杜仲林技术经济分析[A];中国林业技术经济理论与实践[C];2006年

2 吴德康;狄留庆;刘圣金;宋燕;;杜仲的不同加工方法对其质量的影响研究[A];2006海峡两岸暨CSNR全国第七届天然药物资源学术研讨会论文集[C];2006年

3 高鹏;康向阳;尹鸿刚;王尚德;;高温诱导杜仲2n花粉的研究[A];第二届中国林业学术大会——S2 功能基因组时代的林木遗传与改良论文集[C];2009年

4 刘月凤;袁慧;陈建文;;杜仲及其利用的研究进展[A];2003全国家畜内科学学术研讨会论文专辑[C];2003年

5 王介庆;;杜仲活性成份提取液在家禽生产中的应用(摘要)[A];中国畜牧兽医学会2003年学术年会论文集[C];2003年

6 侯惺;吕文海;;近十年杜仲药理研究述要[A];中华中医药学会中药炮制分会2008年学术研讨会论文集[C];2008年

7 张芙蓉;唐延林;;散射光测定杜仲中的松脂醇二葡萄糖苷[A];第十五届全国分子光谱学术报告会论文集[C];2008年

8 张磊;;杜仲配子与合子细胞染色体加倍技术研究[A];第六届全国林木遗传育种大会论文集[C];2008年

9 葛玉珍;;杜仲的真伪识别[A];中华中医药学会学术年会——创新优秀论文集[C];2002年

10 陆长根;盛宁;吴菊兰;;杜仲资源及其综合开发利用[A];第六届全国系统与进化植物学青年学术研讨会论文摘要集[C];2000年

相关重要报纸文章 前10条

1 周平平邋本报记者 丁莹;春茶上市杜仲香[N];中国质量报;2008年

2 本报记者 王卫华;委员呼吁建立杜仲产业化循环经济体系[N];贵州政协报;2011年

3 马志超 程俊杰 商玉玲;植物的“活化石” 致富的“金钥匙”[N];河南日报;2007年

4 刘思龙;传统补药话杜仲[N];中国特产报;2000年

5 樊天林;杜仲宜加密种植[N];中国医药报;2003年

6 武　魏;种植杜仲蕴商机[N];中国中医药报;2002年

7 本报记者 徐华;汝州开建“杜仲种植示范园”[N];农民日报;2011年

8 刘学医 安徽中医药高等专科学校;杜仲的真伪鉴别[N];中国中医药报;2012年

9 河北任丘市华北油田华美综合服务处 邓运川;杜仲栽培管理技术[N];中国花卉报;2011年

10 礞石;“藕断丝连”的杜仲[N];医药养生保健报;2005年

相关博士学位论文 前10条

1 李铁柱;杜仲4种活性成分合成系列基因多样性及序列特征[D];中南林业科技大学;2015年

2 李煜;杜仲高密度遗传连锁图谱构建与重要数量性状的分子标记[D];西北农林科技大学;2015年

3 于靖;杜仲种质资源及其果实质量评价[D];西北农林科技大学;2015年

4 冯延芝;杜仲种仁转录组测序及FAD3基因的鉴定与功能研究[D];中国林业科学研究院;2016年

5 杜红岩;杜仲含胶特性及其变异规律与无性系选择的研究[D];中南林学院;2003年

6 王大玮;杜仲遗传连锁图谱构建及重要性状的分子标记[D];西北农林科技大学;2011年

7 刘世会;杜仲蛋白纯化、序列分析及抗菌活性研究[D];贵州大学;2008年

8 黄伟;杜仲不同产地遗传差异及化学组分分析[D];中国林业科学研究院;2014年

9 张强;植物抗氧化活性成分检测新方法及杜仲抗氧化活性研究[D];西北农林科技大学;2011年

10 赵铁蕊;中国杜仲产业发展态势、生产效率及优化策略研究[D];北京林业大学;2015年

相关硕士学位论文 前10条

1 何文广;杜仲不同器官杜仲胶含量、相对分子质量及其分布的动态研究[D];西北农林科技大学;2009年

2 陈竹君;杜仲林地营养状况及施肥效应研究[D];西北农林科技大学;2002年

3 张京京;杜仲籽的发育规律和质量控制研究[D];河南大学;2015年

4 焦惠丽;杜仲籽制油工艺及产品品质研究[D];河南工业大学;2016年

5 陈毅烽;慈利县杜仲资源调查与优树选择[D];中南林业科技大学;2016年

6 林开勤;杜仲EST-SSR标记开发与性别鉴定[D];贵州大学;2016年

7 张缓;杜仲抗皮肤衰老活性成分的筛选及其作用机制研究[D];河南大学;2016年

8 徐燕茹;杜仲有效成分对秀丽隐杆线虫寿命的影响[D];河南大学;2016年

9 田己鑫;杜仲炮制原理及杜仲雄花速溶茶的研制[D];河南大学;2016年

10 张荣荣;土壤干旱下杜仲截干苗生长和光合生理响应及引种栽培研究[D];山西农业大学;2016年

，

本文编号：1606726