miRNA-17-92基因簇在非糖尿病性巨大儿发生中的作用及其机制研究

发布时间：2018-03-16 02:24

  本文选题：miRNA　切入点：NDFMS　出处：《南京医科大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：巨大儿是指出生体重超过4000g的足月活产新生儿。随着人们生活水平的不断提高,巨大儿的发生率呈明显上升趋势。巨大儿分娩不仅会增加围产儿窒息死亡或肩难产的风险,还会增加剖宫产的几率以及母体损伤,如产程异常、大量出血、产伤等并发症。此外,胎儿期的肥胖也会影响至儿童期甚至成年后,巨大儿成年后更易患心血管疾病、肥胖症和糖尿病等代谢性疾病。巨大儿的发生虽与妊娠期糖尿病密切相关,近年来随着对妊娠期糖尿病的筛查普及以及规范化管理,糖尿病性巨大儿的发生率逐渐下降,而非糖尿病性巨大儿(Non-diabetic fetal macrosomia, NDFMS)的发生率却呈不断上升趋势,其具体分子机制仍不清楚。新生儿出生体重异常带来健康风险,如何将成年疾病的预防提前是当今卫生领域内的研究热点。因此,揭示NDFMS的发病机制,寻求更有效的治疗和干预手段,对提高人口素质具有重要意义。胎盘因素是巨大儿形成的重要原因,大量研究表明,非编码RNA调控在胎盘发生及功能维持中发挥着重要作用,MicroRNA (miRNA)表达紊乱与胎儿生长发育异常密切相关。本研究以NDFMS及自然妊娠足月单胎子代的胎盘组织为研究对象,检测分析miRNA的表达谱,进而通过体外培养滋养层细胞模型进行各分子间调控的机制验证,探讨miR-17-92基因簇在NDFMS发生中的作用及调控机制,以期为揭示NDFMS发病机理及其潜在诊断和治疗的易感性生物标志物提供理论依据。第一部分NDFMS和正常对照胎盘中miRNA表达谱分析目的筛选出NDFMS胎盘组织中差异表达的miRNA分子,获得NDFMS和正常对照胎盘中miRNA表达谱。方法收集10例NDFMS胎盘组织和10例正常对照胎盘组织,提取RNA,应用TaqMan(?) MicroRNA芯片筛选出NDFMS胎盘组织中差异表达的miRNA分子,采用实时定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)在样本中进行验证。结果miRNA芯片筛选出NDFMS和正常对照胎盘中55条miRNAs在两个组中的表达水平差异达8倍以上,其中表达上调的有15条,表达下调的有32条,miR-17-92基因簇的6条miRNAs存在差异表达。结论1. miRNA表达谱芯片可用于分析胎盘组织miRNA表达谱；2.通过TaqMan(?) MicroRNA芯片筛选出NDFMS胎盘中表达失衡的一系列miRNA;3.miR-17-92基因簇的6条miRNAs在芯片中均存在差异表达,可为下一步开展NDFMS胎盘组织miRNA的功能研究提供实验依据。第二部分miR-17-92基因簇在NDFMS发生中的作用及其调控机制目的以第一部分miRNA表达谱芯片结果为基础,本部分内容主要探讨miR-17-92基因簇在NDFMS中的作用及其调控机制。方法采用qRT-PCR技术检测miRNA及其mRNA在胎盘及孕妇外周血中的表达；通过瞬时转染技术使细胞的miR-17-92基因簇异常表达：应用Transwell试验、CCK-8、EdU试验和流式细胞技术评价细胞生物学功能；采用生物信息学软件miRTarBase database预测miRNA的潜在靶基因；Western blot技术检测靶基因的蛋白表达；通过双荧光素酶报告基因试验体外验证miR-17-92基因簇及其靶基因的结合。结果1.细胞周期信号通路是miR-17-92基因簇miRNAs调控靶基因的最主要富集通路；2.miR-17-92基因簇miRNAs在转录水平可调控MAD4、SMAD3、RBI和EP300的表达,而在翻译后的蛋白水平仅调控SMAD4和RB1的表达；3.miR-17-92基因簇]miRNAs可促进滋养层细胞增殖、抑制细胞凋亡,并使细胞进入S期过多；4.参与miRNA成熟过程的2个酶Dicer、Drosha在NDFMS的表达水平明显高于正常对照组；5.miR-17-92基因簇miRNAs用于诊断NDFMS的受试者工作特征曲线(Receiver Operating Characteristic curve, ROC曲线)的曲线下面积为80.53%,敏感性为82.61%,特异性为69.57%。结论1.高表达的miR-17-92基因簇miRNAs可在蛋白质水平对SMAD4、RBI基因的表达进行调控,改变胎盘滋养细胞的增殖、凋亡功能,从而促进NDFMS的发生。2.miR-17-92基因簇miRNAs组合可以作为潜在的非侵入性生物学标志物用于NDFMS的预测诊断。
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本文编号：1617933