甜橙CsMYBF1基因的功能鉴定和调控机理研究

发布时间：2018-03-19 17:29

本文选题：柑橘　切入点：MYB　出处：《华中农业大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：柑橘是世界上最重要的果树之一,富含种类丰富的苯丙烷类化合物。苯丙烷类化合物作为植物中重要的次生代谢类物质,在柑橘果实品质的形成及对逆境的抵御等方面都起到了重要作用。苯丙烷类化合物的代谢调控机制研究是有效利用此类化合物的基础,而目前柑橘中苯丙烷类化合物代谢调控的研究仍非常之少,这也一定程度上限制了柑橘中相关遗传改良工作的开展。MYB转录因子是植物中最大的转录因子家族之一,参与了植物中众多生物学过程的调控,MYB转录因子调控植物苯丙烷代谢的相关功能在多种植物中已有广泛的报道。本研究以柑橘中的MYB转录因子为切入点,通过生物信息学方法,在全基因组范围内鉴定了MYB家族各成员的相关信息。并从中挑选出CsMYBF1作为候选基因,对其潜在的调控苯丙烷代谢的相关功能及机制展开了深入研究。主要研究结果如下:1.甜橙基因组范围内R2R3类型的MYB家族成员分析。从甜橙基因组中共鉴定出100个R2R3类型的MYB转录因子,其中有87个基因不均匀地分布在9条染色体上,以2号染色体上分布为最多。甜橙中存在21个片段复制和8个串联复制的MYB基因。构建了甜橙与拟南芥中MYB家族成员的进化树,将甜橙中的100个MYB转录因子分为29个亚族,MYB基因的基因结构及保守基序分析进一步证实了分类结果的可靠性。转录组数据和定量PCR实验提供了各MYB成员的基因表达信息,结合基因间的进化关系特点,本研究预测了各MYB基因的功能,为后期开展柑橘中MYB基因的功能研究提供了参考。2.CsMYBF1基因的功能鉴定及调控机理研究。从组学分析结果中挑取了可能与黄酮醇类化合物调控相关的CsMYBF1做进一步的功能分析。利用RACE技术克隆得到了CsMYBF1基因全长,进化分析表明CsMYBF1与已报道的黄酮醇调控相关的MYB基因有较近的亲缘关系。基因表达分析表明,CsMYBF1基因在果皮组织、幼果果肉及新叶中有较高的表达。亚细胞定位分析显示CsMYBF1定位在细胞核中。拷贝数分析显示CsMYBF1基因在多个柑橘类型中均为单拷贝。转录激活分析表明CsMYBF1可能需要与其他蛋白形成复合体来行使其转录激活的功能。将CsMYBF1基因超量表达转入番茄,成功得到了转基因番茄植株。次生代谢产物分析表明,转基因番茄果实中羟基肉桂酸类化合物含量明显增加,黄酮醇类物质含量没有显著差异。数字表达谱分析鉴定出了一系列差异表达基因,包括糖酵解途径、莽草酸途径及苯丙烷途径中的多个差异基因。在柑橘愈伤中干涉CsMYBF1基因的表达,显著降低了愈伤组织中羟基肉桂酸类、黄酮醇类及黄酮类化合物的含量。定量PCR结果表明一系列柑橘中苯丙烷途径结构基因的表达也明显降低。在山金柑中干涉CsMYBF1基因的表达也得到了相似的结果。启动子激活实验表明,CsMYBF1可以激活番茄和柑橘中苯丙烷途径上的多个结构基因的启动子。进一步分析表明,CsMYBF1可以激活柑橘中但不能激活番茄中的CHS基因启动子;CsMYBF1可以通过作用于MYPLANT顺式元件直接激活相应的苯丙烷途径结构基因启动子。酵母单杂交与EMSA实验进一步证实CsMYBF1可以直接与MYBPLANT顺式元件结合。本研究还筛选鉴定到甘油处理可以通过诱导CsMYBF1的表达来调控苯丙烷代谢物的积累。本研究初步建立起了CsMYBF1基因的上下游调控网络,明确了CsMYBF1调控柑橘中羟基肉桂酸和黄酮醇类物质代谢的功能。在番茄中超量表达CsMYBF1不能诱导黄酮醇的积累,可能是由于番茄中CHS基因的启动子不被CsMYBF1激活导致的,而启动子中MYBPLANT元件的序列差异可能是其中的一个重要原因。
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【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S666.4

【参考文献】