玉米幼胚胚性愈伤组织诱导能力全基因组遗传解析及候选基因功能研究

发布时间：2018-03-20 18:56

  本文选题：玉米　切入点：胚性愈伤组织诱导率　出处：《四川农业大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：玉米是全世界重要的粮食作物和能源作物,中国虽然是全世界玉米第二大生产国,但是缺乏抗逆、抗病、高配合力和适应性广的优质玉米种质资源。转基因育种是改良玉米种质资源的重要途径之一。玉米幼胚诱导的胚性愈伤组织是国际上广泛采用的转基因玉米受体类型,但由于生产上使用的玉米骨干自交系胚性愈伤组织诱导率普遍很低,而不能直接作为转基因的受体材料。传统的转基因玉米育种流程要经过遗传转化、自交纯合、回交转育及杂交组培几个环节,一般从转基因阳性材料自交纯合到回交转育获得转基因骨干自交系至少需要3-6年。玉米胚性愈伤组织诱导率因材料间基因型不同而差异较大,克隆控制胚性愈伤组织诱导率主效基因,解析玉米胚性愈伤组织诱导机理,创制更多的高胚性愈伤组织诱导率玉米自交系有利于整个玉米转基因育种领域的快速发展。本研究选取301份遗传丰富、胚性愈伤组织诱导能力具有代表性的自交系组成的自然群体和高胚性愈伤组织诱导率自交系18-599R作为供试材料,结合全基因组关联分析与Solexa数字基因表达谱等手段鉴定控制胚性愈伤组织诱导能力、调控胚性愈伤组织诱导过程的的基因。主要研究结果如下：1.以遗传丰富的301份玉米自交系为材料,通过2014年和2015年两个环境种植材料,授粉12天左右,选取幼胚大小在1.0-1.5mm的玉米材料挑取幼胚接种到含有2,4-D的诱导培养基上诱导胚性愈伤组织,于挑胚后第7天统计每个材料的芽长、出芽率,15,20,25天调查胚性愈伤组织诱导率。经过统计后发现其中胚性愈伤组织诱导率在40%～80%的材料有3个,30%～40%的材料有3个,20%～30%的材料有12个,10%～20%的材料有25个,0%～10%的材料有69个,0%的材料有188个。2.采用44243个最小等位基因频率大于5%的高质量SNP,结合群体结构、亲缘关系通过TASSEL软件进行全基因组关联分析。两个环境下共检测到25个SNP与胚性愈伤组织显著相关(P0.0001),其中仅有1个两环境下共性SNP分布于玉米染色体bin 1.05,25个SNP共筛选到15个候选基因。根据基因注释功能发现这些候选基因可能参与蛋白结合、ATP结合、线粒体构成、电子传递、蛋白激酶活性等生理生化过程。另外对出芽率和芽长也进行全基因组关联分析,两个环境下共检测到36个SNP与出芽率显著相关,其中共同检测到与出芽率显著相关的SNP 10个,28个SNP筛选到20个候选基因。根据基因注释功能发现这些候选基因可能参与转移酶活性,蛋白激酶活性,能量传递及异构酶活性等功能。另外两个环境下共检测到53个SNP与芽长显著相关,共同检测到与芽长显著相关的SNP 6个,31个SNP筛选到31个候选基因,根据基因注释功能发现这些候选基因可能与磷酸转移反应调节因子活性,解旋酶活性,甲基转移酶活性,氧化还原酶活性及水解酶活性等功能相关。3.以高诱导率自交系18-599为材料,将幼胚胚性愈伤组织诱导过程划分为胚膨大期、初级愈伤形成期、胚性愈伤组织形成期,利用数字表达谱(DGE)测序进行基因表达分析,结果表明未培养幼胚(CK)、幼胚膨大期(Stage Ⅰ)、初级愈伤组织形成期(Stage Ⅱ)、胚性愈伤组织形成期(Stage Ⅲ)分别有18951(14.55%),18359(56.42%),18140(15.83%),17870(15.5%)测序标签可以比对到玉米基因组上；分别在3个培养阶段检测到4825、5119、5463个差异表达的基因；在3个阶段存在超过5倍表达水平差异的基因中分别有199、230、250个基因是上调表达。而下调表达的基因比较稀少,在3个时期分别仅有52、94、63个基因。说明在玉米幼胚胚性愈伤组织诱导过程激活了大量基因的表达。4.COG分子功能注释结果显示,差异表达基因主要参与细胞构成,信号转导,生理代谢等生物过程。KEGG Pathway分析结果表明Stage Ⅰ中差异表达基因主要富集在脂肪酸生物合成,细胞色素代谢外源性物质,α—麻酸新陈代谢途径,Stage Ⅱ中差异表达基因主要富集在丙酮酸盐代谢,植物激素的生物合成,脂肪酸的生物合成,Stage Ⅲ中差异表达基因主要富集在丙酮酸盐代谢,糖酵解／糖原异生,苯丙素类生物合成。另外,植物激素信号传导通路也是三个阶段均检测到的显著通路。5.本研究通过关联分析研究遗传丰富的301份玉米自交系材料胚性愈伤组织率,筛选与胚性愈伤组织诱导率相关基因,同时通过数字基因表达谱研究高胚性愈伤组织诱导率材料18-599R幼胚(对照),1-5天(Stage Ⅰ)、6-10天(Stage Ⅱ)、11～15天(Stage Ⅲ)材料,寻找幼胚在脱分化时期的差异表达基因。将通过关联分析筛选得到的相关候选基因与差异表达基因进行对比,发现与三个性状显著关联的相关候选基因有一部分也能在差异表达基因中找到。这些共性基因将是后续实验关注的重点。6.我们对植物激素信号传导通路中由MYB138介导的GA信号传导通路进行了初步的验证,发现外源GA3通过促进玉米幼胚不定芽的生长而抑制胚性愈伤组织的诱导。ZmMYB138基因的拟南芥同源基因突变体atmyb65比野生型COL胚性愈伤组织诱导率下降了约20%,这部分叶片组织在诱导过程中产生变态芽而导致脱分化的失败。
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【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S513
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本文编号：1640378