菰黑粉菌T型和MT型菌株差异性研究及b基因功能分析

发布时间：2018-03-20 21:31

本文选题：菰黑粉菌　切入点：差异性　出处：《中国计量大学》2016年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：菰黑粉菌(Ustilago esculenta)属于担子菌亚门黑粉菌科,其侵染茭白植株(Zizania latifolia)后能够引起植株茎部膨大形成可食用的茭白。田间种植发现,茭白存在正常茭白、灰茭、雄茭三种表型,其中正常茭白中的菰黑粉菌以菌丝态(mycelia-teliospore,M-T)存在,而灰茭中则主要为冬孢子(teliospore,T)形态。研究认为,菰黑粉菌与茭白的形成密切相关,而正常茭和灰茭中的菰黑粉菌之间是否存在差异尚不明确。本研究首先通过显微操作的单孢分离技术,分别从灰茭及正常茭白中分离得到了T型与MT型中的一对菰黑粉菌性亲和单倍体菌株,命名为UeT14(CCTCC AF 2015016)、UeT55(CCTCC AF 2015015)与UeMT10(CCTCC AF 2015020)、UeMT46(CCTCC AF 2015021),并在体外成功实现了单倍体性亲和菌株的融合及菌丝的生长。同时通过构建过表达EGFP核定位蛋白的菰黑粉菌菌株,结合人工接种侵染技术对菰黑粉菌生活史展开研究,明确了菰黑粉菌不同生长阶段的形态变化。进一步对T型和MT型菰黑粉菌的研究表明两者存在较大的差异,T型菰黑粉菌具有更强的环境适应性。具体表现为:在不同的碳源及氮源培养基上,T型菰黑粉菌单倍体生长速率较快;营养条件及理化条件对T型及MT型菰黑粉菌融合及菌丝生长的影响不同,T型菰黑粉菌能够在多种氮源及碳源培养基上融合及生长;同时,T型菰黑粉菌能适应更大范围的pH、活性氧水平及多种疏水性条件,其性亲和单倍体菌株融合及菌丝生长能力比MT型强。对T型及MT型菰黑粉菌基因组信息进行SNP分析发现,MT型菰黑粉菌中存在大量的致病基因突变。而黑粉菌的致病性多与其二型态转换(单倍体转换为菌丝型)相关,负责调控黑粉菌形态转换的主要因子为其遗传交配基因,其中b基因主要调控菌丝生长。因此本研究进一步对菰黑粉菌中b基因的功能开展研究。首先通过简并引物结合全基因组信息对4个菰黑粉菌单倍体菌株中的遗传交配b位点及其中的b基因进行克隆及生物信息学分析,结果表明:与玉米黑粉菌类似,每个b位点上存在两个功能基因,分别为bE(b-East)基因与bW(b-West)基因,两者的3’端均为保守区,5’端均为多变区。其中UeT14菌株中为b1,包含bE1和bW1;UeT55、UeMT46菌株中为b2,包含bE2和bW2;Ue MT10菌株中为b3,包含bE3和bW3。进一步我们通过PEG介导的原生质体转化方法对不同菌株中的b基因分别敲除后进行体外融合试验,结果发现:b基因的缺失对单倍体菌株的融合没有明显的影响,而对菌丝的生长影响较大,只有存在至少一对不同位点的bE基因与bW基因时单倍体菌株才能够融合并生长菌丝,其作用模式与玉米黑粉菌相似。因此我们进一步对菰黑粉菌中b基因上下游基因(Kpp2、Prf1、Kpp6、Rbf1、Clp1)进行了克隆并通过qRT-PCR在试验菌株体外融合过程的不同阶段对其及剩余b基因的动态表达进行检测分析,结果显示Kpp2、Prf1、Kpp6基因在单倍体融合及菌丝生长过程中持续表达,而b基因在单倍体融合后出现明显的上调表达,而在菌丝生长受到抑制后,Rbf1、Clp1等基因的表达没有明显的变化,推测与玉米黑粉菌类似,菰黑粉菌中b基因受到Kpp2、Kpp6和Prf1诱导并通过Rbf1、Clp1等基因作用于菰黑粉菌的菌丝生长,具体作用机制及途径还需进一步试验证实。
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【学位授予单位】：中国计量大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S645.2

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