高山被孢霉生物合成共轭亚油酸重组菌株的构建及研究

发布时间：2016-11-06 13:45

  本文关键词：亚油酸异构酶基因在产油真菌中的异源表达及产物的生物合成，由笔耕文化传播整理发布。

《江南大学》 2015年

高山被孢霉生物合成共轭亚油酸重组菌株的构建及研究

郝丹辉  

【摘要】：共轭亚油酸(Conjugated linoleic acid,CLA)是一类含有共轭双键的十八碳二烯酸,其中两种最重要的活性单体分别是cis-9,trans-11-CLA和trans-10,cis-12-CLA,均具有抗癌、抗动脉粥样硬化、增强机体免疫力等生理功能。其中trans-10,cis-12-CLA还可以减少体内脂肪积累,增加肌肉组织含量。由于传统的化学合成方法存在着耗能大、副产物多等诸多问题,使得生产条件温和、产物专一的生物法合成CLA的开发受到了越来越广泛的关注。高山被孢霉(Mortierella alpina)是一种多不饱和脂肪酸(PUFAs)工业生产丝状真菌,可以积累脂质达到自身干重的50%。虽然高山被孢霉不具有合成CLA的能力,但是其亚油酸含量可以达到脂肪酸总量的10%左右,可作为亚油酸异构酶的潜在底物。为了实现在高山被孢霉中生物合成CLA,以改善其功能性脂肪酸组成,提高商业应用价值,本研究通过异源表达痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)的亚油酸异构酶(PAI),使得重组菌株具有了生物合成CLA的能力。并使用密码子优化、外源添加底物和特异性抑制剂的方法,通过不同策略提高重组菌株生产CLA的能力。对于高山被孢霉脂质合成的基础理论研究及产品开发均具有重要的意义。本课题主要结果如下:1.高山被孢霉异源表达亚油酸异构酶重组菌株的构建。首先PCR扩增出天然PAI基因(PAI),同时根据高山被孢霉的密码子使用偏好表,对PAI序列进行密码子优化,获得密码子优化后的o PAI基因,并构建异源表达PAI的表达载体p BIG2-ura5s-PAI和p BIG2-ura5s-o PAI,经根癌农杆菌介导转化尿嘧啶营养缺陷型高山被孢霉,获得稳定遗传的转化子。同时对根癌农杆菌介导转化条件进行了优化。2.亚油酸异构酶基因在高山被孢霉重组菌株中表达情况的研究。对密码子优化前后PAI和o PAI基因的转录水平、蛋白表达水平进行了分析。所有重组菌株中目标基因均明显转录,且密码子优化前后对转录水平无明显影响,但经过密码子优化的PAI基因(o PAI)的重组菌株PAI蛋白表达量较未优化的有明显提高。重组菌株经发酵培养和脂质组成分析表明,重组菌株与野生型菌株的产脂率和脂肪酸组成均无明显差异,但在其中一株转化子M.alpina-o PAI-3中检测到微量的CLA,经气相质谱联用仪鉴定为trans-10,cis-12-CLA异构体,该结果表明异源表达的PAI蛋白具有活性,可催化生物合成CLA。3.影响高山被孢霉重组菌株CLA产量的限制因素及优化策略的研究。对异源表达PAI的高山被孢霉重组菌株CLA产量低的原因进行分析发现,高山被孢霉积累的脂肪酸主要以甘油三酯的形式存在,游离态形式存在的亚油酸含量极少,故PAI的底物极少。在添加0.2%(w/w)外源底物游离态亚油酸以及5μM长链酰基辅酶A合成酶(ACSL)抑制剂后,M.alpina-o PAI-3中CLA产量分别达到了1.02%.和1.21%。两者同时添加使CLA产量提高到了4.05%,与最初发酵培养的重组菌相比产量提高了近80倍。说明高山被孢霉在生物合成CLA方面具有很大的潜力。

【关键词】：
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q936
【目录】：

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