出芽短梗霉ApHAL3基因功能研究及功能位点分析

发布时间：2018-03-26 07:21

  本文选题：出芽短梗霉　切入点：ApHAL3　出处：《沈阳农业大学》2017年硕士论文

【摘要】：HAL3蛋白家族是高度保守的黄素蛋白家族,酵母中的HAL3蛋白是一种Ppz蛋白磷酸酶的抑制因子,而拟南芥、水稻中的HAL3蛋白与大肠杆菌Dfp蛋白的N端具有非常相似的功能,即:4'-磷酸泛酰半胱氨酸脱羧酶(PPCDC)功能。PPCDC为辅酶A合成过程的关键酶,它可以催化4'-磷酸泛酰半胱氨酸(PPC)脱羧生成4'-磷酸泛酰巯基乙胺(PP)。HAL3蛋白还和生物的耐盐性高度相关,该基因的过表达能够提高植物的转基因株系对渗透胁迫、盐胁迫的耐性。出芽短梗霉是一种耐盐性较强的真菌,出芽短梗霉中ApHAL3基因的功能目前尚未有人报道。本文对出芽短梗霉ApHAL3基因的功能及功能位点进行了研究。对出芽短梗霉ApHAL3基因编码的氨基酸序列进行分析,发现该氨基酸序列与大肠杆菌中编码PPCDC的Dfp蛋白N端序列、拟南芥AtHAL3a、酿酒酵母ScHAL3以及水稻OsHAL3蛋白序列有较高的一致性。ApHAL3蛋白也具有寡聚黄素蛋白半胱氨酸脱羧酶蛋白家族的四个保守结构域:(Ⅰ)PXMNXXMW结构域(Ⅱ)组氨酸结构域(Ⅲ)底物结合结构域和(Ⅳ)底物识别夹结构域。为了研究ApHAL3基因的功能,本文利用RT-PCR技术克隆得到ApHAL3蛋白的cDNA序列并构建质粒载体,利用PPCDC缺陷的大肠杆菌ΔdZp突变体菌株进行功能互补实验。通过温度敏感表型和营养缺陷实验分析可知:APHAL3可以功能互补大肠杆菌PPCDC缺陷的突变体菌株Δdfp。该结果表明ApHAL3蛋白具有PPCDC的功能。构建多个携带点突变ApHAL3蛋白的载体,利用互补实验发现:ApHAL3中保守的 Leu40、Trp106、Met120、Asn172、Cys212、Met220 以及 Ser116Ala117Asn118Ser119 是 PPCDC活性的关键位点;而His100和Met175这两个单点突变可以降低ApHAL3蛋白的PPCDC活性,表现为大肠杆菌Δdfp的转化子在42℃培养时的生长速率下降;Va120、Arg105、Ala170、Leu202、Ala211、Asp214、Gly216 以及 Asp235 单点发生突变不影响 ApHAL3 蛋白的互补功能。分别用 1 mol/L、1.5 mol/L 和 2 mol/LNaCl 处理出芽短梗霉 4 h、8 h、12 h、20 h,利用qRT-PCR检测出芽短梗霉ApHAL3基因在盐胁迫下的转录水平。结果表明:NaCl浓度为1 mol/L、1.5 mol/L和2 mol/L时,在盐胁迫12 h时,ApHAL3基因的表达量显著下调;NaCl浓度为1 mol/L和1.5 mol/L时,在盐胁迫20h,ApHAL3基因的表达量稍微上调,但不显著。
[Abstract]:The HAL3 protein family is a highly conserved family of flavin proteins. The HAL3 protein in yeast is an inhibitor of Ppz protein phosphatase. In Arabidopsis thaliana and rice, the HAL3 protein has very similar function to the N-terminal of Dfp protein in Escherichia coli. That is, the function of PPCDC.PPCDC is the key enzyme in the synthesis of coenzyme A. it can catalyze the decarboxylation of PPC4 to produce PPN. HAL3 protein is also highly related to the salt tolerance of organisms. Overexpression of this gene can improve the tolerance of transgenic plants to osmotic stress and salt stress. The function of ApHAL3 gene was not reported. The function and function site of ApHAL3 gene were studied in this paper. The amino acid sequence of ApHAL3 gene was analyzed. The amino acid sequence and the N-terminal sequence of Dfp protein encoding PPCDC in Escherichia coli were found. Arabidopsis thaliana AtHAL3a, Saccharomyces cerevisiae ScHAL3 and Rice OsHAL3 protein sequence highly consistent. ApHAL3 protein also has four conserved domains of oligoflavin protein cysteine decarboxylase protein family (鈪，

本文编号：1666904