根癌农杆菌介导获得稗草转基因小麦的研究

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第3期张 彬等:根癌农杆菌介导获得稗草Ecppc转基因小麦的研究 357

水稻、小麦等均为C3植物,较低的光合效率成为限制其单株生物产量进一步提高的重要因素。人们受到C4光合途径的启发,希望通过转基因技术改造水稻、小麦等C3植物,以增强其叶片的光合能力,从而达到提高光合效率和产量的目的。磷酸烯醇式

丙酮酸羧化酶(PEPC)作为C4光合作用的首要关键酶,一直是研究的热点。Ku等

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基因小麦的光合速率最大增加39%。农杆菌介导植物的转化方法具有导入外源片段完整,插入拷贝数少,嵌合体比例少的特点。本研究通过根癌农杆菌遗传转化系统,将具有自主知识产权的稗草PEPCcDNA基因

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(GenBank登录号:AY251482)导入小

麦,分析影响小麦转化效率的重要因素,研究该基因在小麦基因组中的整合、转录、翻译以及表达产物在转基因后代的酶活效应和光合能力,为进一步分析PEPC的过量表达对小麦光合性能的影响提供试验材料。

首先将玉米PEPC

的完整基因用农杆菌介导法导入水稻,获得了PEPC活性显著提高的转基因水稻植株,活性最大增加

110倍,PEPC约占总可溶性蛋白的12%。而且与对照相比,转基因植株光合特征也发生了改变,高浓度氧气对光合的抑制作用显著减弱。转基因水稻的光合生理特征已有不少报道,证明转基因水稻具有初级的CO2浓缩机制,在高温高光强的条件下,气孔导度、耐光抑制的能力大大增强,净光合速率提高55%,CO2补偿点下降27%,产量最大增加30%。张方等将高粱的ppc基因导入水稻中,也获得了光合速率增加的结果。这些工作表明通过转入ppc基因可以改善作物的光合作用。

目前将ppc基因导入小麦的研究还较少。陈绪清等用基因枪的方法将玉米的ppc基因导入小麦,获得了PEPC活性提高3~5倍的转基因小麦,转

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1 材料和方法

111 供试材料

取不同基因型小麦(TriticumaestivumL1)春性栽培品种Bobwhite、扬麦12和扬麦158幼胚,诱导并筛

选其胚性愈伤组织作为转化的起始外植体材料。112 菌株、质粒

根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)LBA4404、EHA105和C58c1为本研究室保存,含稗草磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(Ecppc)的植物表达载体pUb-iEcppc(图1)由本实验室构建

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。利用冻融法将表。

达载体转入3种根癌农杆菌中

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图1植物表达载体pUb-iEcppc的T-DNA插入区结构示意图

Fig11SchematicmapoftheT-DNAregionofthevectorpUb-iEcppc

P35S:花椰菜花叶病毒35S启动子;Pubi:玉米泛素基因启动子;TNOS:胭脂碱合成酶终止子;Hpt:潮霉素磷酸转移酶基因;

Gus:B葡萄糖苷酸酶基因;Ecppc:稗草ppc基因cDNA编码区。

P35S:cauliflowermosaicvirus35Spromoter;Pubi:maizeubiquitingenepromoter;TNOS:nopalinesynthasegeneterminator;Gus:B-glucuronidasegene;

Hpt:hygromycinphosphotransferasegene;Ecppc:codingregionofppcgenefromEchinochloacrusgalli1

113 组培转化小麦胚性愈伤组织

挑取小麦胚性愈伤组织,夹碎,于侵染培养基(OD600=018左右)中浸泡,振荡40min后,弃去菌液,用滤纸将愈伤组织吸干后置于共培养基上,25e避光培养3d。然后将愈伤组织转入洗菌培养基中浸泡30min,用以抑制农杆菌生长。用滤纸吸干后25e避光恢复培养1周。再放入筛选培养基中避光筛选,每代12d,连续筛选2代。经过筛选的抗性愈伤组织在继代培养基中每天光照16h,恢复培养1周后,转入分化培养基。试管苗经过在壮苗生根培,

移栽到大田中生长至结实。小麦组织培养和转化过程中使用的各种培养基见文献[12-14]。114 转化体的鉴定

11411 转化植株的PCR筛选 取对照和抗性愈

伤组织再生植株(T0代)的幼嫩叶片012g左右,用CTAB法微量提取小麦叶片总DNA

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,用于转化植

株的PCR筛选。用引物Shpt(5c-AAAAAGCCTGAACTCACCGC-3c)和Ahpt(5c-ACTTCTACACAGCCATCG-GT-3c)扩增潮霉素抗性基因,可扩增出1kb的产物,扩增程序为94e3min;94e40s,55e50s,72e130;PCR

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