Halomonas socia NY-011~T中四氢嘧啶合成基因簇ectABC和ectD的克隆及其功能鉴定

发布时间：2018-03-28 18:51

  本文选题：Halomonas　切入点：socia　出处：《应用与环境生物学报》2017年01期

【摘要】：由ectA、ectB、ectC和ectD编码的酶可以催化对细胞起保护作用的四氢嘧啶类物质的生物合成,嗜盐菌新种Halomonas socia NY-011~T ectABC和ectD为四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶的生产提供新的基因来源.通过SEFA-PCR步移方法从Halomonas socia NY-011~T中克隆ectA、ectB、ectC和ectD基因,并分别构建ectABC和ectD的原核表达质粒,在E.coli BL21(DE3)中异源表达,利用SDS-PAGE对重组蛋白进行鉴定,通过ACQUITY UPLC MS/MS检测四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶的生成.结果显示:H.socia NY-011~T的四氢嘧啶合成基因ectA、ectB、ectC形成基因簇ectABC(KP717055-57),大小为2 506 bp,四氢嘧啶羟化酶基因ectD大小为942 bp(KP717058),与近源种H.elongata DSM258同源性分别为81%和78%;SDS-PAGE检测到4种融合蛋白,大小(M_r)分别为21.6×10~3、46.4×10~3、14.4×10~3、55.3×10~3,与预期相符;利用ACQUITY UPLC MS/MS发现仅表达ectABC的重组菌株[E.coli BL21(DE3)/pltac-ABC]中只存在四氢嘧啶,而在表达ectABC和ectD的重组菌株[E.coli BL21(DE3)/pltac-ABC/pETect D]中检测到四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶.本研究从H.socia NY-011~T中分离得到的四氢嘧啶类物质的合成基因,能够在E.coli BL21(DE3)中异源表达并行使功能,为四氢嘧啶类物质异源生产提供了新的基因来源.
[Abstract]:Enzymes encoded by ectAminectBnectC and ectD can catalyze the biosynthesis of tetrahydropyrimidines, which are protective to cells. Halomonas socia NY-011~T ectABC and ectD provide a new gene source for the production of tetrahydropyrimidine and hydroxy tetrahydropyrimidine. By SEFA-PCR step method, ectAminectBnectC and ectD genes were cloned from Halomonas socia NY-011~T, and the prokaryotic expression plasmids of ectABC and ectD were constructed, respectively. The recombinant protein was identified by SDS-PAGE. The formation of tetrahydropyrimidine and hydroxy tetrahydropyrimidine was detected by ACQUITY UPLC MS/MS. The results showed that the gene ectABCf717055-57, size 2 506bpand tetrahydropyrimidine hydroxylase gene ectD was 942 bpKP717058, which was a gene cluster of ectABCf717055-57, which is similar to the near source H.elongata. The homology of DSM258 and SDS-PAGE were 81% and 78%, respectively. ACQUITY UPLC MS/MS showed that only tetrahydropyrimidine was present in E.coli BL21(DE3)/pltac-ABC, which was 21.6 脳 10 ~ (3), 46.4 脳 10 ~ (3), 14.4 脳 10 ~ (3), and 55.3 脳 10 ~ (3), respectively, and that only tetrahydropyrimidine was present in the recombinant strain [E.coli BL21(DE3)/pltac-ABC] expressing only ectABC by using ACQUITY UPLC MS/MS. In the recombinant strain [E.coli BL21(DE3)/pltac-ABC/pETect D] expressing ectABC and ectD, tetrahydropyrimidine and hydroxy tetrahydropyrimidine were detected. The synthesis genes of tetrahydropyrimidines isolated from H.socia NY-011~T can be expressed and function in E.coli BL21DE3. It provides a new gene source for allogenic production of tetrahydropyrimidines.
【作者单位】： 四川大学生命科学学院资源与生态环境教育部重点实验室;
【基金】：国家自然科学基金项目(30970043)资助~~
【分类号】：Q78

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本文编号：1677597