PCSK9基因沉默和替格瑞洛对动脉粥样硬化斑块细胞凋亡的影响及机制探讨

发布时间：2018-04-01 06:58

  本文选题：前蛋白转化酶枯草溶菌素9　切入点：动脉粥样硬化　出处：《天津医科大学》2016年博士论文

【摘要】：背景:动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是许多重要血管事件的病理基础,目前是导致人类各种致死病因的首位。随着人民生活水平的提高及人口的老龄化,动脉粥样硬化的发病率逐年上升,因而对AS的发病机制及病理过程进行深入探讨具有重大的社会效益和经济效益。AS发病机制十分复杂,有关学说甚多,目前认为AS是一种以脂质沉积异常为特征的慢性炎症性疾病。诸多AS危险因素中,氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)是促进内皮细胞凋亡的最主要原因。Ox-LDL可以促进平滑肌细胞、单核/巨噬细胞、内皮细胞的凋亡、增殖和迁移,以及引起内皮细胞的氧化应激反应和细胞损伤,最终导致AS斑块形成。前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)是和常染色体显性高固醇血症相关的新型基因,可以降解肝细胞表面的低密度脂蛋白受体(LDLR),使循环中低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)清除障碍,增加血浆中LDL-C水平,从而参与胆固醇代谢的调节,促进AS的进展。但是,PCSK9是否可以通过影响内皮细胞功能对AS产生直接的毒性作用,至今没有突破性进展。替格瑞洛是新型的血小板抑制剂,通过和P2Y12受体结合,抑制血小板活性,防止冠心病患者发生血栓事件,但是替格瑞洛是否可以参与调节内皮细胞功能对AS有直接的影响未见报道。目的:本研究拟通过RNA干扰技术下调PCSK9基因,以慢病毒包装转染入人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中,在ox-LDL刺激下测定凋亡率及凋亡相关蛋白表达量,观察下调PCSK9对细胞凋亡的影响,并进行可能的机制探讨;将替格瑞洛应用于小鼠及HUVEC,观察其对AS斑块及内皮细胞功能的作用。方法:本研究分三部分1、应用高脂喂养Apo E基因敲除小鼠构建动脉粥样硬化模型:18只健康雄性4-6周龄小鼠:正常组:野生型C57BL/6J小鼠(8只);模型组:高脂喂养Apo E-/-小鼠(5只);替格瑞洛组:高脂喂养Apo E-/-小鼠,替格瑞洛灌胃10天(5只)。(1)喂养20周,测定血清血脂水平;(2)解剖小鼠,分离主动脉,进行病理学切片,行HE染色,观察血管形态;免疫组织化学测定斑块内PCSK9表达情况;masson染色,观察血管斑块形态。2、体外培养HUVEC。(1)ox-LDL以不同浓度、不同时间刺激HUVEC,观察PCSK9、Bax、caspase3、Bcl-2表达情况;应用流式细胞仪检测细胞凋亡情况;(2)设计合成两对针对PCSK9的是sh RNA,以慢病毒为载体转染入HUVEC,细胞分为三组:279-vector(control group)、sh RNA-PCSK9-1 group以及sh RNA-PCSK9-2 group。三组细胞在ox-LDL 50μg/ml刺激24h,检测PCSK9表达水平,计算抑制效率;检测PCSK9、Bax、caspase3、Bcl-2以及MAPK通路相关蛋白表达情况;流式细胞仪检测各组细胞凋亡率;(3)细胞划痕实验:测定sh RNA-PCSK9对细胞迁移能力的影响;(4)细胞黏附实验:检测sh RNA-PCSK9对内皮细胞和细胞外基质黏附作用的影响。3、替格瑞洛体外实验。将替格瑞洛添加到内皮细胞培养基中,以ox-LDL 50μg/ml刺激24h。(1)流式细胞仪检测细胞凋亡率;(2)检测替格瑞洛对PCSK9、Bax、caspase3、Bcl-2以及MAPK通路相关蛋白m RNA和蛋白表达水平的影响;(3)观察替格瑞洛对细胞黏附作用的影响。结果:1、构建动脉粥样硬化模型。(1)高脂喂养Apo E基因敲除小鼠20周,成功建立动脉粥样硬化模型;(2)高脂喂养后血脂水平明显升高,但替格瑞洛组较模型组血脂水平无明显差异(P0.05);(3)HE结果显示,正常组主动脉内膜光滑完整,模型组主动脉内有明显的斑块形成,替格瑞洛组斑块面积减小,病变进展缓慢;免疫组化结果提示动脉粥样斑块内PCSK9表达量高,替格瑞洛使PCSK9表达减少。2、体外培养HUVEC。(1)ox-LDL 50μg/ml和100μg/ml刺激HUVEC发生凋亡,24h细胞凋亡达到峰值,两浓度之间无差异;转染sh RNA-PCSK9细胞凋亡率下降;(2)50μg/ml ox-LDL刺激HUVEC,激活PCSK9、Bax、caspase3,下调Bcl-2,呈时间依赖性(P0.05);(3)RT-PCR和western blot结果提示sh RNA-PCSK9使细胞内PCSK9、Bax、caspase3、p-p38、p-JNK表达下降(P0.05),Bcl-2表达升高(P0.05);(4)sh RNA-PCSK9对细胞迁移、细胞黏附无明显影响。3、体外培养HUVEC。(1)ox-LDL刺激下,替格瑞洛使细胞凋亡率下降;(2)RT-PCR和western blot结果提示替格瑞洛使细胞内PCSK9、Bax、caspase3、p38/p-p38、JNK/p-JNK、ERK/p-ERK表达下降(P0.05),Bcl-2表达升高(P0.05);(3)替格瑞洛作用下和细胞外基质黏附的内皮细胞增多。结论:1、高脂喂养Apo E基因敲除小鼠20周可以成功建立动脉粥样硬化模型;PCSK9在斑块内表达升高;替格瑞洛可减少斑块内PCSK9表达,并减轻斑块病变,其稳定斑块的作用独立于降脂效应。2、ox-LDL刺激HUVEC可出现细胞凋亡,sh RNA-PCSK9可以通过抑制p-p38和p-JNK信号通路减弱下游Bax、caspase3活性、增强Bcl-2活性而抑制细胞凋亡;下调PCSK9对细胞黏附和细胞迁移无明显影响。3、替格瑞洛可以通过下调Bax、caspase3、上调Bcl-2表达水平抑制ox-LDL诱导的HUVEC凋亡,并且可能是通过抑制MAPK相关蛋白p38/p-p38、JNK/p-JNK、ERK/p-ERK实现的;替格瑞洛可以促进内皮细胞和细胞外基质的黏附;替格瑞洛可以下调HUVEC中PCSK9的表达水平。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R543.5

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本文编号：1694444