叶脉发育相关基因CkERF2和CkCOV1在柠条叶脉响应干旱中的表达研究

发布时间：2018-04-01 23:00

  本文选题：柠条　切入点：维管组织　出处：《西北农林科技大学》2017年硕士论文

【摘要】：柠条集中分布在我国干旱和半干旱地区,在形态、生理和分子水平均对干旱做出适应性响应。目前对其形态和生理水平的干旱适应性特征已有较多报道,但分子水平的抗旱研究还处于起步阶段。本研究针对柠条在干旱加剧条件下叶柄维管束和叶脉更加发达的形态特征,从分子水平探究叶脉分化发育关键基因CkERF2和CkCOV1在柠条维管组织中的功能,为扩展深化柠条维管组织响应干旱的分子机制提供实验依据。论文获得如下结果:(1)从柠条叶样中提取总RNA,反转录获得第一链cDNA,通过RT-PCR的方法克隆CkERF2基因,经测序表明:克隆得到转录因子CkERF2序列756 bp,编码252个氨基酸,通过NCBI在线数据库Blastn比对表明不同物种间该基因的同源性较高,并且所含的AP2结构域三维结构与拟南芥中的一致。(2)采用BL21大肠杆菌原核表达的方法产生融合蛋白,纯化后作为免疫原,免疫实验用兔,获得CkERF2兔源多克隆抗体,经Western Blotting实验检验多克隆抗体的特异性,结果表明,获得的多克隆抗体可以特异性的与原核表达蛋白发生免疫反应,并且原核表达蛋白大小以外的区域检测不到信号。说明成功克隆到特异性较高的多克隆一抗。(3)以自然干旱梯度上的柠条叶样为试验材料,通过qRT-PCR和Western Blotting技术,分别从转录水平和翻译水平检测CkERF2及其蛋白的相对表达量,结果表明随着干旱胁迫的加剧,柠条叶样中CkERF2及其蛋白表达量均呈现上升趋势。说明干旱胁迫时,柠条CkERF2在基因水平和蛋白水平均做出响应。(4)利用pCAMBIA1302载体中的GFP绿色荧光蛋白,构建重组载体pCAMBIA1302-CkERF2,使CkERF2和GFP绿色荧光蛋白融合表达,瞬时转化30 d苗龄的本氏烟草,横切和纵切烟草叶片主脉,荧光显微镜下观察实验结果,CkERF2蛋白定位于维管组织木质部中,推测CkERF2可能在调控原形成层细胞向木质部分化的过程中扮演重要角色。(5)构建pGBKT7-CkERF2重组载体,将pGBKT7-CkERF2重组载体和pGADT7空载体转化至酵母菌感受态细胞中,涂布在营养缺陷固体培养基上,观察菌落生长状况。酵母自激活实验表明转化有pGBKT7-CkERF2和pGADT7载体的酵母菌,在三缺和四缺培养基上均能很好生长,并且在含有X-gal的四缺培养基中可以发生颜色反应,说明CkERF2具有转录自激活活性,为后续寻找CkERF2的互作蛋白提供试验基础。(6)同克隆CkERF2相同的方法,从柠条叶样中克隆得到CkCOV1基因长为946 bp的序列,其中开放阅读框为777 bp,编码258个氨基酸,推测该蛋白分子量为28.84 KD,等电点为5.46,是一种疏水蛋白,并用生物信息学软件MEGA 5构建聚类树分析该基因的亲缘关系;最后利用qRT-PCR方法进行柠条干旱胁迫下叶样该基因表达水平的定量分析。随着干旱的加剧,该基因在柠条叶样中的表达量呈现下降趋势。表明柠条CkCOV1基因的下调表达与维管系统积极响应干旱有关。综合以上研究结果得出结论:柠条基因CkERF2和CkCOV1分别通过正向和负向调控方式在维管组织响应干旱而致叶脉愈加发达的过程中起重要调控作用,尤其是转录因子基因CkERF2在干旱下柠条叶脉向木质部分化和发育中起关键作用。
[Abstract]:The expression of CkERF2 , CkERF2 and CkCOV1 was studied by means of reverse transcription polymerase chain reaction ( RT - PCR ) and Western Blotting technique . ( 5 ) The recombinant vector pGBKT7 - CkERF2 was constructed . The recombinant vector pGBKT7 - CkERF2 and pGADT7 empty vector were transformed into yeast competent cells .

【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q943.2;S793.3
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本文编号：1697653