家蝇差异基因Md-FBPⅠ、Md-CBPⅠ及Md-LSZⅠ的原核表达及活性检测

发布时间：2018-04-03 23:43

  本文选题：家蝇　切入点：差异基因　出处：《吉林农业大学》2016年硕士论文

【摘要】：抗生素是兽医临床使用最广泛的抗感染药物,但因其广泛不合理的使用,使得多种病原菌对其产生了抗性。为此,研发新型广谱且不易产生耐药性的抗生素替代药物已迫在眉睫,抗菌肽就属于其中一类。自然界中的抗菌肽不仅来源于动植物,也来源于昆虫,家蝇抗菌肽因具有低毒、低耐药性等诸多特点,已引起了国内外科研工作者的广泛关注。利用基因工程技术对家蝇抗菌肽及其免疫反应机制进行研究成为了当前的热点。本研究以牛多杀性巴氏杆菌和鸡源沙门氏菌诱导家蝇幼虫构建的抑制性消减文库(SSH)中筛选得到的部分差异表达基因为基础,以其cDNA为模板,通过cDNA末端快速扩增(RACE-PCR)技术对三个差异基因进行扩增,拼接其全长序列,并对全长序列进行Blast分析以及生物信息学分析。将其中两个基因(即家蝇溶菌酶Ⅰ基因和家蝇几丁质结合蛋白Ⅰ基因)的全长PCR产物进行纯化后通过T-A克隆方法克隆到pMD-18T载体上,成功构建了阳性克隆质粒。将筛选出的基因亚克隆至pET-32a原核表达载体中,成功构建原核表达质粒并于大肠杆菌BL21(DE3)及Transetta(DE3)中获得高效表达,上述基因的表达产物纯化后均获得了融合蛋白。进一步对纯化产物的亲和活性及体外抑菌活性进行了研究。主要实验结果如下:(1)利用RACE-PCR技术成功扩增出三个差异基因的全长cDNA序列,其ORF序列大小分别为303bp,429bp,366bp。Blast分析结果表明家蝇溶菌酶Ⅰ基因(Md-LSZⅠ)与登录号为XP_011292185.1的家蝇溶菌酶1类似物基因的同源性为98%(第44位,46位和73位不相同)。家蝇几丁质结合蛋白基因(Md-CBPⅠ)与登录号为XP_011296921.1的家蝇幼虫表皮蛋白9类似物基因的同源性为98%(第89位不相同)。Md-FBPⅠ基因与登录号为XP_011297661.1的家蝇果糖二磷酸醛缩酶基因的同源性为99%(第68位不相同);其中两个基因(即家蝇溶菌酶Ⅰ基因和家蝇几丁质结合蛋白Ⅰ基因)生物学信息分析结果显示:Md-LSZⅠ基因共编码143个氨基酸,理论等电点为5.22,为疏水性蛋白,生物活性位点预测发现73位氨基酸位于磷酸化位点。Md-CBPⅠ基因共编码122个氨基酸,理论等电点为5.63,为亲水性蛋白,对保守型区域预测发现89位氨基酸位于该基因保守基序中;二级结构预测结果显示,β-折叠,无规则卷曲,α-螺旋和β-转角结构均为这两种基因编码蛋白质的主要结构。(2)成功构建了重组表达质粒pET-32a-Md-LSZⅠ和pET-32a-Md-CBPⅠ,并在大肠杆菌中获得了高效表达。其中Md-LSZⅠ基因的融合蛋白表达形式为包涵体蛋白,Md-CBPⅠ基因的表达形式为可溶性蛋白。将上述表达产物纯化后均获得条带单一的融合蛋白。(3)Md-CBPⅠ融合蛋白的亲和活性检测结果表明Md-CBPⅠ融合蛋白对几丁质以及纤维素均有一定的结合作用,且对几丁质的结合作用相对较好。抑菌试验检测表明,Md-LSZⅠ融合蛋白对鸡源沙门氏菌有一定的抑菌作用,对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌无明显抑菌作用。Md-CBPⅠ融合蛋白对以上三种病原菌均无明显抑菌作用。以上研究成果不但对进一步研究上述三种融合蛋白的作用机制奠定了基础,也对家蝇抗菌蛋白功能及相关功能免疫机制的研究提供了相关依据。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78

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本文编号：1707422