水稻ABP cDNA克

发布时间：2016-11-11 13:08

  本文关键词：Waxy基因的RNA沉默使转基因小麦种子中直链淀粉含量下降(英文)，由笔耕文化传播整理发布。

《四川农业大学》 2008年

水稻ABP cDNA克隆、原核表达及RNA沉默载体构建

文春描  

【摘要】： 高等植物中普遍存在的生长素吲哚乙酸(IAA),对植物的生长发育(如植株形态、器官分化、种子形成等)起着重要的调节作用。生长素结合蛋白(auxin-bindingprotein,ABP)是生长素调节过程中信号传导的先驱,它与生长素一起调节植物的生长发育过程,在细胞中的含量水平既关系到细胞的相对生长,又直接影响细胞对生长素的敏感性。 水稻是世界上最重要的粮食作物之一,也是重要的模式植物之一,深入研究水稻ABP基因的功能及其调控方式并获得突变材料将为水稻遗传改良打下坚实基础。本研究以粳稻日本晴幼苗的RNA为材料,用RACE及重组PCR技术克隆ABP全长cDNA,并对其序列进行了生物信息学分析和预测。同时,利用获得的ABP进行了原核表达载体构建及RNA沉默载体构建、表达研究等,为获得水稻产量、品质和抗性方面的突变材料作了一些探索性的工作。主要研究结果如下: 1、克隆了水稻ABP全长cDNA,测序结果已登录到GenBank,登录号为EU595028。该cDNA全长920 bp(polyA除外)编码206个氨基酸。含有GAGA转录顺式作用元件、核糖体结合位点(RBS)、polyA加尾信号、糖皮质激素作用位点等转录因子作用位点。序列分析显示所得核苷酸序列与玉米生长素结合蛋白基因(zm-ABP1)的核苷酸序列同源性达79%,氨基酸序列同源性达78%,同样具有3个氨基酸保守结构域,C端内质网识别信号KDEL和1个糖基化位点(NSTF),表明此基因在不同物种间保守性较高。跨膜预测分析显示,水稻ABP在1-44号氨基酸信号肽部分存在跨膜区。因此,推测水稻ABP可能是一种大量存在于内质网的分泌型蛋白,且位于质膜进行信号传导时与其它蛋白锚定。二级结构与三级结构预测显示,其功能结构域主要集中于β-片层结构区域,该区域与ABP的生物学功能关系密切,预测综合分析显示可形成有效结合生长素的区域。 2、分别构建包含水稻ABP全长cDNA和编码框的原核表达载体,以大肠杆菌BL21(DE3)pLysS为蛋白表达系统尝试进行了GST融合表达,以获得纯化的水稻ABP进行生化、免疫和蛋白质相互作用方面的研究。但经诱导时间和诱导剂浓度梯度多次筛选,并未观察到与阴性对照有差异条带,因此可初步认为水稻ABP表达的条件特殊,不能在此原核表达系统中有效表达或者水稻ABP对大肠杆菌的生长不利导致不能有效表达。 3、为了能用外界诱导因素调控植物体内的RNA沉默,用来自拟南芥的HSP18.2热激启动子构建热激诱导型真核表达载体pCAMBIA1301-HSP,并通过GUS基因的表达证明此表达载体能在热激条件下有效表达水稻愈伤组织中的外源基因。根据水稻ABP cDNA序列和水稻基因组序列的比对结果,确定了水稻ABP基因的外显子和内含子的位置关系,通过引物设计和重组PCR方法得到以水稻ABP基因内含子为茎环结构,外显子为反向互补序列的DNA发夹结构片段。在此基础上构建了热激诱导型的RNA沉默载体pCAMBIA1301-HSP-ABP并转化水稻愈伤组织以获得水稻ABP基因诱导型缺陷突变材料。转化后的材料死亡,推测存在可能因ABP缺损导致了细胞生长停止或致死。因此,下一步的研究可在表达载体上插入阻遏蛋白基因,提高诱导型载体的严谨性。

【关键词】：
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：S511
【目录】：

摘要3-5

Abstract5-9

第一章 文献综述9-21

1 植物ABP研究进展9-16

1.1 ABP的性质与细胞定位9-10

1.2 ABP的结构及功能位点10-12

1.3 ABP基因12-13

1.4 ABP的分子机制及作用原理13-15

1.5 受体的终结15

1.6 展望15-16

2 RNA沉默技术及其在植物中的应用16-19

2.1 RNA干扰机理及优势16-17

2.2 RNA干扰设计及技术方法17-18

2.3 RNA干扰技术在植物中的应用18

2.4 前景展望18-19

3 立题思想19-21

第二章 水稻生长素结合蛋白全长cDNA的克隆、序列及结构分析21-38

1 材料与方法21-29

1.1 实验材料21

1.2 实验方法21-29

2 结果与分析29-35

2.1 水稻ABP mRNA的RT-PCR29-30

2.2 水稻ABP全长cDNA TA克隆质粒鉴定30

2.3 水稻ABP cDNA序列测定及结果分析30-31

2.4 水稻ABP氨基酸序列及高级结构分析结果31-35

3 讨论35-38

3.1 水稻ABP全长cDNA结构分析35

3.2 水稻ABP结构分析35-38

第三章 水稻生长素结合蛋白的原核表达研究38-49

1 材料与方法38-43

1.1 实验材料38-39

1.2 实验方法39-43

2 结果与分析43-46

2.1 水稻ABP全长cDNA编码框TA克隆质粒的构建43-44

2.2 水稻ABP全长cDNA重组pGEX-4T-2原核表达质粒构建44-45

2.3 水稻ABP cDNA编码框序列重组pGEX-4T-2原核表达质粒构建45-46

2.4 水稻ABP在原核表达系统中的表达研究46

3 讨论46-49

3.1 关于原核表达质粒pGEX-4T-2和宿主菌46-47

3.2 关于重组原核表达载体的构建策略47

3.3 关于水稻ABP在原核表达系统中无效表达分析47-49

第四章 水稻生长素结合蛋白的RNA干扰研究49-59

1 材料与方法49-52

1.1 实验材料49

1.2 实验方法49-52

2 结果与分析52-57

2.1 载体pCAMBIA1301-HSP构建及鉴定52-55

2.2 真核表达载体pCAMBIA1301-HSP-ABP构建及转化55-57

3 讨论57-59

3.1 HSP18.2启动子在水稻愈伤组织中的启动效率57

3.2 水稻ABP基因RNA沉默载体的构建57

3.3 转化RNA沉默载体的水稻愈伤组织死亡57-59

参考文献59-63

致谢63-64

发表文章64

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本文编号：170911