六个烟草品种的抗性筛选及小桐子中抗性相关基因的克隆和功能验证

发布时间：2018-04-10 17:29

  本文选题：烟草 + 生理生化指标　； 参考：《云南师范大学》2017年硕士论文

【摘要】：烟草是我国的重要经济作物,也是云南省的支柱产业,作为一种典型的喜温作物,其整个生长发育期对水分需求很敏感。干旱和低温是影响烟草产量和品质的重要逆境因素,因此准确地鉴定并筛选出抗性优良的烟草品种是亟待解决的生产难题。本研究首先通过生理生化指标测定和隶属函数统计分析法,对六个烟草品种的抗旱性和抗低温性进行综合评价,为烟草的抗性品种选育和生产提供指导信息。作为新兴的能源植物之一,小桐子所具备的种子含油量高、油质优良等特性使其备受关注,尤其是它能够在极端气候和土壤条件下生长,表现出对干旱、低温和盐分等胁迫因子具有一定的耐受性。因此,阐明小桐子对不同逆境胁迫耐受性形成的生理生化及分子机理,将极大地推动小桐子的抗逆遗传工程改良。本实验室前期借助Illumina高通量测序获得了三个抗性相关基因基因JcP5CR、JcERF、JcSP1,基于此,本研究成功克隆获得其完整编码区序列,并构建了植物表达载体,通过在烟草中的过量表达,对转基因烟草株系的耐逆性进行分析,初步验证了不同抗性相关基因在耐逆性形成中的作用,为小桐子抗逆性遗传改良提供了重要的基因资源。通过研究得到以下主要结果:1.六个不同烟草品种的抗旱性和抗冷性的比较筛选和综合评价对六个烟草品种在苗期分别进行空气干旱或4℃低温胁迫处理,对叶片的多重胁迫伤害指标和抗性指标进行测定,包括电导率、丙二醛、含水量、脯氨酸、可溶性糖含量,最终运用隶属函数法综合评定出六个品种的抗旱性和抗低温性分别进行综合评价.发现干旱胁迫下单育2号平均隶属函数值最高,为7.48,其次为云烟85,为5.04,而云烟116的抗旱性最差,为1.62;低温旱胁迫下单育2号平均隶属函数值最高,为0.72,其次为云烟85,为0.707,而Yatas-6的抗低温性最差,为0.263。2.小桐子JcP5CR基因在烟草中过表达耐逆性研究克隆获得JcP5CR基因的完整编码区(CDS),全长828 bp,编码蛋白由270个氨基酸组成。以10%PEG模拟干旱胁迫处理小桐子幼苗48 h,通过实时荧光定量PCR分析发现,随着胁迫时间的增长,小桐子叶片中JcP5CR基因的转录水平持续升高,到48 h时达到了对照(未经胁迫)的8.73倍。将JcP5CR基因片段亚克隆至双元植物表达载体pBI121,经农杆菌介导的叶盘转化法转化模式植物烟草(Nicotiana tabacum Xanthi),获得过表达JcP5CR的阳性植株。对脯氨酸含量的测定显示,野生型烟草的脯氨酸含量约为18.56 ug.g~(-1),为转基因株系的87%;经空气干旱胁迫3 d后,转基因烟草叶片中脯氨酸含量达到9.14mg.g~(-1),为野生型的0.33倍。对T1代种子在胁迫下的发芽率进行测定,发现在低温(12℃)处理10天后,野生型烟草的种子发芽率仅为70%,而转基因株系的种子发芽率达到98.5%;在PEG胁迫15天后,野生型烟草的种子发芽率仅为35.6%,而转基因株系的种子发芽率达到71.4%,表现出低温和高盐耐受性的升高。3.小桐子JcERF基因的克隆及转基因烟草的耐逆性分析克隆获得一个小桐子ERF类转录因子,其CDS区为729 bp,对推测的编码蛋白进行保守功能域搜索,显示含有保守的AP2/ERF结构域。对其启动子区域进行功能元件预测,发现在转录起始位点上游1500 bp处存在ERF响应元件(ERE)。构建双元植物表达载体pBI121-JcERF,并获得过表达JcERF的阳性烟草植株,并对T1代转基因株系对高盐和低温胁迫下的耐受性进行初步分析。结果显示,将转基因和野生型烟草叶盘置于不同浓度NaCl溶液中进行失绿分析,发现第三天约30%的野生型叶片已明显白化,而转基因烟草叶片还未出现白化,表现耐盐性的升高。经低温胁迫(0℃)处理24 h后,转基因烟草的电解质渗透率仅为野生型烟草的0.69%,而脯氨酸和可溶性糖含量至少达到野生型的3.82倍和1.72倍。对T1代烟草种子在低温12℃下的萌发率进行统计,发现胁迫15天后,转基因烟草种子的发芽率高达野生型3.89倍。这些结果显示转录因子JcERF的过表达赋予转基因烟草对高盐和低温胁迫较强的耐受性。4.小桐子JcSP1基因在烟草中过表达耐逆性研究在实验室前期的的研究基础上,获得过表达JcSP1的转基因烟草植株。经过对转基因烟草进行48h的高温胁迫处理,转基因烟草叶片的相对电导率只有野生型烟草叶片相对电导率的87.56%;转基因烟草叶片和野生型烟草叶片的可溶性糖含量及可溶性蛋白含量都有显著上升,可溶性糖含量和可溶性蛋白分别高于野生型烟草叶片0.57倍、0.14倍,表现出较强的高温耐受性。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：云南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q943.2;S572;S794.9

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