铁调节蛋白2基因敲除小鼠铁代谢异常及其对骨代谢的影响

发布时间：2018-04-12 15:59

本文选题：骨质疏松症 + 铁代谢　；参考：《河北医科大学》2017年硕士论文

【摘要】：目的:观察铁调节蛋白2(Iron Regulatory Protein 2,Irp2)基因敲除小鼠体内铁代谢和骨代谢的改变,探讨铁代谢紊乱在老年小鼠骨质疏松症发病中的作用及其机制。方法:本课题拟利用15月龄铁调节蛋白2基因敲除C57BL/6雌性小鼠(Irp2~(-/-) ,内源性铁过载模型)为研究对象,另外选择6只同月龄健康雌性野生型(Irp2~(+/+))小鼠作为对照组。取小鼠第6腰椎行Micro CT并三维重建;对第6腰椎进行骨组织切片,并行普鲁士蓝铁染色及HE染色,观察骨组织铁沉积情况和骨组织的结构变化;采用原子吸收光谱法检测小鼠第6腰椎骨铁、骨钙、骨磷以及小鼠肝铁含量;Realtime PCR法检测骨组织中铁代谢相关基因[膜铁转运蛋白1(Ferroportin-1,Fpn1)、转铁蛋白受体1(Transferrin receptor-1,Tfr1)、铁蛋白轻链(Ferritin light chain,Ftl)、铁调素(Hepcidin)],及骨代谢相关基因[骨组织中碱性磷酸酶(Bone alkaline phosphatase,Balp)、骨钙素(Bone Gla Protein,Bglap)、Ⅰ型胶原α1链(TypeⅠcollagen alpha 1 chain,ColⅠα1)、组织蛋白酶K(Cathepsin K,Ctsk)、活化T细胞核因子(Nuclear factor of activated T-cells cytoplasmic 1,Nfatc1)、核因子κB受体活化因子(Receptor activator of nuclear factorκB,Rank)、抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate-resistant acid phosphonatase,Trap)]的表达情况;Western-blot方法检测骨组织中铁代谢相关蛋白的表达水平;比色法检测血清铁,微板法检测血清钙水平,酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清中反映成骨细胞活性(Balp、Bglap、COLⅠα1)和破骨细胞活性[Ctsk、Trap、Ⅰ型胶原末端片段(C-terminal telopeptide of typeⅠcollagen,CTX-1)]的指标,同法检测血清25羟维生素D3[25(OH)D3]水平和肝组织内维生素D 25-羟化酶(CYP2R1)的活性。结果:1 Micro CT结果显示,与野生型小鼠相比,Irp2~(-/-) 组小鼠骨密度更低,骨小梁稀疏、数量更少,骨小梁的连续性下降、空隙增加,可见多处骨小梁断裂,骨组织结构破坏明显。三维重建相关参数分析显示,和野生型小鼠相比,Irp2~(-/-) 组小鼠第6腰椎骨密度(BMD)和骨小梁数量(Tb.N)显著降低(P分别0.05和0.01);2骨组织切片普鲁士蓝铁染色显示:与Irp2~(+/+)组小鼠相比,Irp2~(-/-) 组小鼠骨铁沉积明显降低;HE染色示:两组小鼠均表现为骨质疏松,Irp2~(-/-) 组小鼠骨小梁更加稀松、薄弱、易断裂,骨质明显下降,骨质疏松症更为严重;3原子吸收光谱法结果示:Irp2~(-/-) 组小鼠肝铁含量明显高于野生组(P0.001),骨铁、骨钙和骨磷含量显著低于野生组小鼠(P0.01或P0.05);4铁代谢相关基因的表达情况:与Irp2~(+/+)组相比,Irp2~(-/-) 组小鼠骨组织中Fpn1和Tfr1基因表达水平明显下降(P0.05),Ftl、Hepcidin基因表达水平显著升高(P均0.05);5骨代谢相关基因的表达情况:Irp2~(-/-) 组小鼠骨组织Balp、Bglap、ColⅠα1等成骨相关基因的表达水平较Irp2~(+/+)组明显下降(均P0.05);Ctsk、Nfatc1、Rank、Trap等破骨相关基因的表达水平显著升高(P0.05或P0.001);6铁代谢相关蛋白的表达情况:Irp2~(-/-) 组小鼠骨组织中铁蛋白重链(Ferritin heavy chain,FTH)、FTL、FPN1和铁调节蛋白1(Iron Regulatory Protein 1,IRP1)表达水平较野生组小鼠显著降低,Tf R1和二价金属离子转运体(Divalent Metal Transporter 1 without iron-responsive elements,DMT1-IRE)蛋白表达水平较Irp2~(+/+)组小鼠明显升高(P分别0.05和0.01);7与Irp2~(+/+)组小鼠相比,Irp2~(-/-) 组小鼠血清铁水平(64.71±5.21μmol/L vs 154.01±65.09μmol/L,P0.01),以及血清Balp(132.93±4.82μmol/L vs166.66±18.83μmol/L,P0.01)、Bglap(1.84±0.17μmol/L vs 2.86±0.19μmol/L,P0.001)和COLⅠα1(20.21±0.91 ng/ml vs 24.98±2.04 ng/ml,P0.001)等反映成骨细胞活性的指标显著降低,血清Ctsk(72.42±1.82μmol/L vs 62.73±7.00μmol/L,P0.05)、Trap(40.63±2.43 U/L vs 36.42±2.77U/L,P0.05)和CTX-1(2.74±0.33μmol/L vs 2.19±0.42μmol/L,P0.05)等反映破骨细胞活性的指标明显升高。与Irp2~(+/+)组小鼠相比,Irp2~(-/-) 组小鼠肝脏25-羟化酶(CYP2R1)(1.21±0.18 ng/mg vs 1.94±0.14 ng/mg,P0.001)活性和血清25羟维生素D3[25(OH)D3](25.63±0.98μmol/L vs28.40±1.66μmol/L,P0.01)水平显著降低。两组间血钙水平无明显差异。结论:1 Irp2基因敲除可导致小鼠体内铁代谢紊乱及铁分布异常(肝铁沉积严重,骨铁含量减少),小鼠骨组织内铁代谢相关基因及其蛋白的表达也发生了明显变化,以代偿Irp2~(-/-) 小鼠体内的铁代谢紊乱。2两组小鼠均发生骨质疏松,Irp2~(-/-) 小鼠骨质疏松程度更加严重。3铁代谢紊乱可加重骨质疏松症的发展。内源性铁过载引起的肝脏CYP2R1活性降低,以及后者引起的25(OH)D3水平降低,可能是Irp2~(-/-) 小鼠发生骨质疏松的重要原因之一。
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【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R580

【参考文献】