大猿叶虫滞育准备期滞育相关蛋白和基因的鉴定及功能分析

发布时间：2018-04-13 05:19

本文选题：大猿叶虫 + 滞育准备期　；参考：《华中农业大学》2016年博士论文

【摘要】：滞育是昆虫应对外界不良环境变化而产生的一种生长发育停滞的状态。然而,昆虫滞育并不是一种完全停滞的状态,包含滞育诱导、准备、启动、维持、解除和滞育后的静息等几个动态的生理阶段。充分的滞育准备对昆虫滞育维持、解除和滞育后的发育等过程至关重要。注定滞育个体在滞育准备期传递滞育诱导期积累的环境信号,“决定”个体是否进入滞育;同时,相比生殖个体,注定滞育个体在滞育准备期积累更多的营养物质。然而,目前对注定滞育个体在滞育准备期重要生理事件的分子调控机制尚未明确。大猿叶虫Colaphellus bowringi Baly是一种十字花科蔬菜上的重要鞘翅目害虫,具兼性滞育特性,以成虫滞育入土越夏和越冬,温度和光周期是诱导大猿叶虫滞育的主要环境因子。大猿叶虫幼虫期是其滞育诱导敏感阶段,25°C时,羽化成虫取食4天左右为滞育准备期,钻土行为易于滞育辨别,是研究滞育准备期分子调控机制的良好材料。本研究以大猿叶虫修水种群(29°1′N,114°4′E)为研究对象,构建了大猿叶虫转录组Unigene数据库,筛选出不同条件下稳定表达的内参基因,采用同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)和RNA-Seq技术鉴定了大猿叶虫滞育准备期差异表达的蛋白和基因,结合RNA干扰(RNA interference,RNAi)和添加外源保幼激素(juvenile hormone,JH)等方法分析了滞育准备期主要生理事件的分子调控机制。主要结论如下:1.大猿叶虫转录组Unigene数据库构建和实时定量PCR内参基因筛选大猿叶虫基因组信息的缺乏和有效内参基因的不确定限制了对其分子调控机制的研究,因此,本研究构建了大猿叶虫转录组数据库、筛选了有效内参基因。利用Illumina测序平台,共获得5.7′106多个reads,组装成39,390个特异序列,平均长度为792 bp。24,070个Unigenes可注释出明确生物学功能,占总Unigenes数目的61.11%。COG功能分析显示,9,048个序列的预测蛋白归属25个生物学功能类别。KEGG数据库比对分析显示,16,951个序列参与了255个代谢通路。RT-PCR验证了11个候选内参基因(GAPDH,RPL32e,RPL19,EF1α,TBP,TBP1,ACT1,ACT2,αTUB,αTUB1,βTUBC)的序列,qRT-PCR分析了这11个候选内参基因在不同发育阶段、组织、性别、品系和光周期条件下的表达,发现RPL19、EF1α和ACT1是不同实验处理下表达最稳定的候选内参基因,RPL19和ACT1可作为内参基因用于大猿叶虫滞育准备期基因表达的研究。转录组数据库的构建和有效内参基因的筛选为后续大猿叶虫滞育准备期的分子调控机制研究提供了有效数据平台。2.大猿叶虫滞育准备起始期差异蛋白鉴定和FABP功能分析滞育诱导信号主要在注定滞育个体的头部被感知和储存,脂质代谢通路可能是将滞育诱导信息转运到滞育准备期的潜在通路。因此,本研究鉴定了大猿叶虫滞育准备起始期头部差异表达的蛋白,并分析了脂肪酸结合蛋白(fatty acid-binding protein,FABP)在滞育准备期的功能。采用iTRAQ技术共鉴定到大猿叶虫雌成虫头部表达的蛋白3,175个,共获得差异表达蛋白297个,滞育准备起始期上调表达的蛋白141个,下调表达的蛋白156个。COG功能分析显示,大量上调表达蛋白聚类到“能量生产和转换”、“碳水化合物代谢和运输”以及“脂质代谢”等代谢功能类别。KEGG分析显示,FABP同时注释到“peroxisome proliferator-activated receptor信号”和“脂肪消化和吸收”通路。滞育准备起始期,RNAi沉默FABP后,注定滞育个体脂肪体膨大受到抑制、脂肪体组织变得松散、脂滴含量减少,同时,Heat shock proteins 21(Hsp21)和Hsp23的mRNA水平显著下调。滞育准备起始期差异蛋白的鉴定和FABP的功能分析说明,脂质代谢信号在滞育准备起始期已被激活,脂质代谢信号参与滞育准备期脂质积累的同时调控了抗逆基因Hsps的转录。3.JH信号调节大猿叶虫滞育准备的营养代谢基因转录前期研究已证实,内分泌系统中的JH信号可调控大猿叶虫注定滞育个体的生殖和滞育。然而,JH信号是否可通过调控注定滞育个体滞育准备期的营养物质代谢,从而调控其生殖和滞育还不清楚。本研究采用RNA-Seq技术鉴定了滞育准备期和产卵前期的差异表达基因(differential expression genes,DEGs),结果表明,羽化后取食0到2天,注定滞育和注定非滞育个体中DEGs的数目均在800-1300个之间;而羽化后取食第2到第4天,注定非滞育个体中的DEGs上调173个、下调152个,注定滞育个体中的DEGs上调2576个,下调1998个,暗示滞育准备期生理调控的复杂性。KEGG聚类分析显示,差异基因主要聚集在碳水化合物、脂质和蛋白等代谢通路,表明营养代谢调控是产卵前期和滞育准备期的主要特征。基因表达模式分析发现,糖酵解和磷酸戊糖途径、脂肪酸合成与甘油酯代谢途径在滞育准备期更活跃,而核糖体途径则在产卵前期更为活跃,这些结果很好地吻合了生殖与滞育个体的营养代谢特征。对JH合成与降解途径的分析表明,JH信号在产卵前期被激活,而在滞育准备期处于静息状态。添加外源JH和RNAi沉默JH受体methoprene-tolerant(Met)实验显示,JH通过受体Met调控产卵前期和滞育准备期营养代谢相关基因的表达。JH-Met信号抑制注定滞育个体的碳水化合物和脂质合成,促进注定滞育个体的蛋白合成,进而调控了生殖发育和滞育准备。4.FAS2调节大猿叶虫滞育准备期的脂质积累和抗逆基因表达目前,已证实脂肪酸合酶(fatty acid synthase,FAS)调节了昆虫滞育过程中的脂质积累。然而,FAS调节的脂质积累是否影响滞育的其他方面还不清楚,如抗逆能力、滞育准备持续期和滞育发生等。通过比对大猿叶虫转录组数据库,鉴定到两个FAS基因序列。蛋白序列功能结构域预测结果显示FAS1蛋白序列包含7个功能结构域,而FAS2包含9个功能结构域;系统进化树分析显示FAS1和FAS2分属2个不同支。在滞育准备期,FAS2的mRNA水平变化较之FAS1更明显,取食2天后,FAS2的mRNA表达显著高于FAS1;取食2天后,注定滞育个体FAS2的mRNA表达显著高于注定非滞育个体FAS2的表达。这些结果暗示着,较之FAS1,FAS2在滞育准备期发挥着更重要的功能。在滞育准备期,RNAi沉默FAS2后,注定滞育个体脂肪体膨大受到抑制、脂肪体组织变得松散、甘油三酯含量减少;超氧化物歧化酶(superoxyde dismutase)的mRNA表达显著下降、谷胱甘肽转移酶(glutathione S-transferase)的mRNA表达显著上升;滞育个体的含水量升高。然而,沉默FAS2对滞育准备持续期和滞育发生无显著影响。添加外源JH和RNAi沉默JH受体Met表明,JH-Met信号通路抑制FAS2的转录。综合可知,JH-Met信号的缺乏可诱导FAS2的表达,促进注定滞育个体的脂质积累,调节其抗逆基因表达和含水量变化。本研究构建了大猿叶虫转录组数据库、筛选出有效内参基因,为大猿叶虫基因功能研究提供了有效数据平台。鉴定到大量滞育准备期差异表达的蛋白和基因,明确了JH-Met信号可通过对营养物质代谢相关基因的转录调节而调控大猿叶虫的生殖发育和滞育准备,发现滞育准备过程的脂质积累可调节抗逆基因表达和含水量变化。研究结果丰富了基因组资源,为研究大猿叶虫滞育调控的分子机制提供了基础资料,为解析大猿叶虫滞育准备期的分子调控机制奠定了基础,为揭示昆虫滞育的分子调控机制提供了线索。
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【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S433.5

【参考文献】