CTX-M-55型超广谱β-内酰胺酶在革兰阴性杆菌中的基因定位、基因环境与传播机制研究

发布时间：2018-04-17 15:42

  本文选题：肠杆菌科细菌 + CTX-M-55　； 参考：《郑州大学》2017年硕士论文

【摘要】：背景与目的由于新型广谱β-内酰胺类抗菌药物和第三代头孢菌素在临床上的广泛使用,造成CTX-M型超广谱β-内酰胺酶(Extended spectrum beta-lactamases ESBLs)检出率呈逐年上升趋势,且在全球范围内传播快速,分布广泛。自1986年首次检出CTX-M酶以来,在社区和医院获得性感染中,CTX-M已成为最为流行的ESBL型别之一,现已在大肠埃希菌、肺炎克雷伯杆菌、变形杆菌等至少26种细菌中发现了CTX-M酶。CTX-M-55酶属于CTX-M-1组,自2004年首次在泰国发现产CTX-M-55型ESBLs的大肠埃希菌至今,已在韩国、中国、印度、日本、美国、英国、俄罗斯等数十个国家快速流行传播,宿主菌包括大肠埃希菌、肺炎克雷伯杆菌、黏质沙雷杆菌、沙门菌属、志贺菌属等十余种病原菌。除人类外,感染宿主还涉及家禽、牲畜、水源、蔬菜、野生动植物等,覆盖人类生存生活的各个领域,对公共卫生产生严重威胁。因此,对CTX-M-55型ESBLs的传播机制的研究有助于遏制其传播,控制其转移,临床意义与社会价值重大。bla_(CTX-M)耐药基因多数存在于质粒,部分可定位于染色体上。耐药基因是否定位于染色体,与菌株的型别有关系。定位于染色上的bla_(CTX-M)耐药基因具有遗传稳定性。质粒是导致bla_(CTX-M)耐药基因水平传播转移的重要因素之一。接合型质粒能通过接合传递在同种或不同种属的细菌之间进行穿梭,导致更多种类细菌的耐药,甚至在局部造成耐药细菌的大规模爆发和流行。bla_(CTX-M)耐药基因的基因环境,及其周围基因元件对耐药基因的表达,转移和传播都有着极为重要的调控作用。如:位于bla_(CTX-M)基因的上游的插入序列ISEcpI可使多种bla_(CTX-M)耐药基因高水平表达并能够携带耐药基因在染色体与质粒之间进行转移,在不同菌种之间进行传播扩散。插入序列IS26、IS903和ORF477也经常与bla_(CTX-M)耐药基因相关。这些可移动元件可随机分布在bla_(CTX-M)耐药基因上下游,并在不同的bla_(CTX-M)耐药基因中组成不同形式的基因组件,共同或单独作用于耐药基因,对其表达进行调控,其传播进行介导。CTX-M型ESBLs快速传播的机制十分复杂。我们前期在临床1株肺炎克雷伯杆菌中首次检出bla_(CTX-M-55)型ESBLs,进一步研究显示CTX-M-55是CTX-M耐药性进程中重要一环,但是对于本地区CTX-M-55是否具有特殊的转移播散能力?是否具有独特的上下游基因结构?国内外流行菌株间是否有相关性尚不清楚。本研究拟通过基因定位、高通量测序准确分析明确基因环境;通过质粒转移接合实验探究其传播机制从而为临床延缓或控制细菌耐药性的升级提供有价值的线索。方法1.菌株收集收集2015年07月至2015年12月半年内,郑州大学第一附属医院细菌室分离的耐三代、四代头孢类抗菌药物的革兰阴性杆菌共357株,所有菌株均采用VitekⅡCompact鉴定至种。2.药物敏感试验和ESBLs表型确证实验利用MIC法进行药敏试验,参照2014年CLSI标准进行药敏结果判读。根据2014年CLSI推荐的ESBLs筛选标准进行初步筛选并进一步采用酶抑制剂增强试验进行确证。3.bla_(CTX-M-55)耐药基因筛选及定位分析采用PCR技术对目的基因进行扩增,扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,挑取阳性片段进行测序分析,初步筛选bla_(CTX-M-55)耐药基因阳性菌株。分别提取bla_(CTX-M-55)耐药基因初筛阳性菌株的染色体和质粒DNA,采用PCR扩增bla_(CTX-M-55),再进行琼脂糖凝胶电泳和测序,确定bla_(CTX-M-55)耐药基因在细菌中的位置。4.传播转移机制分析对定位于质粒上的阳性菌株进行质粒转移接合试验。通过以上试验分析bla_(CTX-M-55)耐药基因的传播转移机制。5.耐药菌株的同源性分析采用多位点序列分型(MLST)对bla_(CTX-M-55)耐药基因阳性的菌株进行同源性分析结果1.bla_(CTX-M-55)耐药基因的检出结果357株ESBLs阳性菌株中共13株病原菌携带bla_(CTX-M-55),且均为肠杆菌科细菌,其中包括大肠埃希菌7株,肺炎克雷伯杆菌3株,弗氏柠檬酸杆菌1株,黏质沙雷杆菌1株和摩根摩根菌1株。非发酵菌中未有bla_(CTX-M-55)耐药基因阳性菌株检出。2.基因定位与质粒转移接合实验结果基因定位分析结果显示所有菌株的bla_(CTX-M-55)耐药基因均被质粒所携带且质粒转移接合实验接合率为100%。3.基因环境检测结果经检测,bla_(CTX-M-55)耐药基因与其上下游基因元件共形成四种不同模式的基因组件。在13株bla_(CTX-M-55)耐药基因上游均发现ISEcp1的存在,其中两株被IS26插入截断,一株被IS1294插入;在12株bla_(CTX-M-55)耐药基因下游发现ORF477,另外1株下游为IS903。ISEcp1?-bla_(CTX-M-55)-?IS903基因组件是一种新型组合形式,在bla_(CTX-M-55)首次检出。10株含有Int1类整合子,1株为Int2类整合子,2株未检出整合子类型。13株bla_(CTX-M-55)耐药基因阳性菌株中有5株同时携带blaTEM,两株同时携带blaTEM和blaSHV。4.MLST分型情况对bla_(CTX-M-55)耐药基因阳性的7株大肠埃希菌和3株肺炎克雷伯杆菌进行MLST分型,共检测出9种ST型别,其中两株来自不同科室(消化内科和ICU)的大肠埃希菌的ST型别一致(ST305),其与菌株的ST均不相同[ST305,ST182,ST381,ST446 and ST2(大肠埃希菌)and ST148,ST269 and ST37(肺炎克雷伯杆菌)]。结论1.CTX-M-55型ESBLs在本地区已然形成多菌种扩散蔓延趋势,尤以肠杆菌科细菌为甚,需引起临床的高度警惕,严防出现院内感染的爆发流行。2.可接合型质粒、ISEcp1等bla_(CTX-M-55)基因周围可移动元件是其在细菌间传播转移的主要因素。临床应增强bla_(CTX-M-55)基因携带菌监测与防控工作,避免耐药基因的局部爆发流行。
[Abstract]:CTX - M - 55 enzyme belongs to CTX - M - 1 group . CTX - M - 55 enzyme is one of the most popular ESBL types . CTX - M - 55 enzyme is one of the most popular ESBL types . This study was carried out by means of PCR to determine the position of the drug - resistant gene of CTX - M - 55 . The results showed that CTX - M - 55 was a key link in the drug resistance . and the local outbreak of the drug resistant gene is avoided .

【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R446.5

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