miR-374a的发现及其靶基因在MERS-CoV感染致病过程中的作用探索

发布时间：2018-04-19 13:11

本文选题：MMDS + BolA3　；参考：《广西医科大学》2017年硕士论文

【摘要】：中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus,MERS-Co V)是一种目前新发现的最大的RNA病毒,具有致病性强、致死率高的特点,其感染和传播给人类带来了新的挑战。但是,目前关于MERS-Co V的致病通路的有关研究很少。micro RNA(mi RNA)作为一类新型的调控因子,在病毒致病过程中起到非常重要的作用。本课题从mi RNA角度对MERS-Co V的致病通路进行了研究,有利于进一步阐明MERS-Co V与宿主之间的相互作用,并为发现抗MERS-Co V的药物提供新的靶点和策略。研究目的探索体内重要调控分子mi RNA在MERS-Co V致病过程中的作用及相关调控分子机制。研究方法1.MERS-Co V感染后的致病通路探索:(1)MERS-Co V感染致病相关mi RNA筛选:预测分析可能在MERS-Co V感染致病过程中具有重要作用的mi RNA。通过MERS-Co V感染的细胞mi RNA表达谱芯片的差异分析,选择信号值有明显变化的mi RNA,利用MTT实验筛选出可能在MERS-Co V感染致病过程中具有重要作用的mi RNA,q PCR验证MERS-Co V感染后该mi RNA在胞内的表达。(2)检测mi R-374a对细胞增殖的影响:将mi R-374a mimics瞬时转染入细胞,利用MTT实验检测mi R-374a的过表达对细胞增殖的影响。(3)预测分析mi R-374a可能靶向的靶基因:通过MERS-Co V感染的细胞m RNA表达谱芯片的差异分析,综合在线分析(Targetscan,pichtar)等方法预测mi R-374a的靶基因,取预测交集,预测到mi R-374a可能靶向Bol A33’UTR,q PCR验证分析的结果。(4)通过q PCR和Western blotting实验方法检测了mi R-374a在m RNA和蛋白质水平上对Bol A3表达的影响。(5)mi R-374a对Bol A3的靶向性研究:构建含有Bol A33’UTR的报告基因载体,与mi R-374a过表达载体共转染入细胞,通过双荧光素酶报告基因检测mi R-374a对Bol A33’UTR的靶向性。2.Bol A3基因的克隆表达及特异性抗体制备:为了研究Bol A3在细胞中的功能,需要进行细胞中Bol A3蛋白表达检测,因为没有用于表达检测合适的市售抗体,我们制备了Bol A3的多克隆抗体。(1)基因克隆:从人肺癌细胞系A549细胞中提取总RNA,通过RT-PCR扩增出Bol A3基因。(2)载体构建:将克隆基因构建入p QE30原核表达载体中。(3)蛋白诱导表达:在大肠杆菌中诱导蛋白表达,Western blotting方法鉴定带有His标签的重组Bol A3蛋白,分析蛋白表达形式。(4)蛋白纯化:使用Ni柱亲和层析法纯化该蛋白。(5)抗体制备:程序免疫大耳白兔,耳缘静脉采血分离免疫后兔血清,ELISA方法检测血清中抗体滴度。(6)抗体鉴定:通过Western blotting方法,检测制备的抗体与原核及真核表达的Bol A3蛋白结合特异性。3.Bol A3在细胞中的定位分布及对ATP生成的研究:(1)蛋白在各组织细胞中的表达:培养多种肺、肝、肾、脑等组织细胞系,裂解细胞,蛋白电泳,通过Western blotting方法利用制备的多克隆抗体检测多种细胞系中Bol A3的内源性表达。(2)真核表达载体构建:PCR扩增出Bol A3基因片段,构建入p MD18-T载体,双酶切从p MD18-T上切下Bol A3基因片段,构建入相同酶切的p EGFP-C1载体中。(3)蛋白定位:构建的EGFP-Bol A3融合表达的真核表达载体,瞬时转染入细胞内,检测到绿色荧光的表达。通过激光共聚焦实验检测绿色荧光的细胞与不同定位荧光标记的共定位情况,检测Bol A3的细胞定位。(4)Bol A3表达抑制对细胞功能的影响:建立Bol A3抑制模型,筛选Bol A3 RNAi的有效区域,构建重组表达Bol A3 RNAi腺病毒,感染细胞后定量PCR法和Western-Blotting方法检测细胞内Bol A3的表达抑制情况,MTT实验检测感染上述腺病毒抑制细胞内Bol A3表达后,对细胞增殖的影响。利用荧光法检测抑制细胞内Bol A3表达对细胞ATP生成的影响。研究结果1.我们在中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-Co V)感染的细胞的表达芯片进行差异筛选中发现:(1)MERS-Co V引起mi RNA差异表达谱分析,筛选出7个信号值有明显上升的mi RNA,并从中筛选出1个可能在MERS-Co V感染致病中有重要作用的mi RNA mi R-374a,通过q PCR验证了MERS-Co V能够促进细胞内mi R-374a的表达;(2)功能实验检测证明mi R-374a在细胞中过量表达可以抑制细胞的增殖;(3)在MERS-Co V影响mi R-374a表达的研究中发现,mi R-374a可能靶向调控Bol A33’-UTR。分析该分子可能在MERS-Co V感染致病通路中起到重要作用;(4)q PCR方法对MERS-Co V在细胞中调控Bol A3表达进行了鉴定,结果显示MERS-Co V感染细胞后,能够抑制细胞内Bol A3;(5)mi R-374a靶向Bol A3的鉴定:q PCR和Western blotting实验验证了mi R-374a能够在m RNA和蛋白质水平上抑制Bol A3的表达;荧光素酶检测报告基因结果说明mi R-374a能够靶向抑制Bol A33’UTR。2.Bol A3蛋白在细胞中的功能研究:(1)抗Bol A3多克隆抗体制备和鉴定:转化构建的Bol A3原核表达载体入M15感受态,诱导蛋白表达,利用纯化获得的蛋白程序免疫大耳白,获得免疫后兔血清,Western blotting方法鉴定所制备抗体对原核及真核表达Bol A3蛋白的结合具有高度特异性;(2)使用制备的抗体检测到Bol A3在人肺、神经、肝和肾细胞系中均有内源性表达,提示其在机体的功能广泛;(3)将成功构建的EGFP-Bol A3融合表达的真核表达载体p EGFP-C1-Bol A3瞬时转染入细胞,激光共聚焦实验,检测到Bol A3蛋白与线粒体标记物共定位于线粒体和细胞核;(4)建立Bol A3抑制模型,制备重组表达Bol A3 RNAi腺病毒,感染细胞,检测其可以有效抑制细胞内Bol A3的表达。使用腺病毒感染细胞,检测到抑制Bol A3的表达能够促进细胞进行性死亡。对其机制进行研究发现:抑制细胞内Bol A3的表达能抑制细胞内能量代谢中的重要分子--ATP的生成。研究结论1.本研究对mi RNA在中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-Co V)感染致病过程中的作用进行了探索。实验结果显示MERS-Co V感染细胞可以影响多种宿主细胞mi RNA的变化,其中MERS-Co V感染可通过促进细胞内mi R-374a的表达而靶向抑制Bol A3的表达,从而影响细胞生存。2.针对mi R-374a的靶基因,本研究对Bol A3基因在细胞中的分布、定位及其对ATP生成的影响进行了研究。研究结果表明Bol A3在肝脏、肾脏、肺和脑等多种组织细胞内均有表达,而且Bol A3的表达能够定位于细胞线粒体。我们利用神经细胞模型进行的实验研究显示,Bol A3表达的下降会影响细胞内能量代谢的重要物质ATP的形成,进而影响细胞的生存。实验研究提示MERS-Co V感染导致Bol A3表达下降可能在MERS病毒感染致病中发挥一定的作用。
[Abstract]:This paper studies the pathogenic pathways of MERS - Co V in the pathogenesis of MERS - Co V infection . ( 3 ) To predict the target gene which may be targeted by mi R - 374a : The target gene of mi R - 374a was predicted by means of the differential analysis of the cell m RNA expression profiling chip of MERS - Co V infection , and the target gene of mi R - 374a was predicted to be targeted to Bol A3 . ( 5 ) Cloning and expression of Bol A3 gene were detected by means of q - PCR and Western blotting . ( 1 ) Cloning of Bol A3 gene was carried out . ( 3 ) Protein - induced expression : Protein expression was induced in E . coli . Western blotting was used to identify the recombinant Bol A3 protein with His tag . The expression of protein was analyzed by Western blotting . ( 3 ) Protein localization : The eukaryotic expression vector expressed by EGFP - Bol A3 fusion was transfected into the cells transiently , and the expression of green fluorescence was detected . ( 4 ) The effect of inhibition of Bol A3 expression on cell function was investigated by means of quantitative PCR and Western blotting . The expression of Bol A3 in human lung , nerve , liver and kidney cell line was investigated . The results showed that the expression of Bol A3 in human lung , nerve , liver and kidney could be inhibited . The decrease of Bol A3 expression can affect the formation of important substance ATP in intracellular energy metabolism , and then affect the survival of the cells . The experimental study suggests that the decrease of Bol A3 expression in MERS - Co V infection may play a role in the pathogenesis of MERS virus infection .

【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R373

【相似文献】