转基因抗虫棉花重组DNA在土壤中分布的实时定量PCR分析

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1934李刚，等：转基因抗虫棉花重组DNA在土壤中分布的实时定量PCR分析

2012年10月

correlationcoefficientswereabove0.998withgoodrepeatability.Allthecopynumberof35S-Cry1Aand35S-nptⅡfragmentsatthethreerhizoplane>rhizosphere>non-rhizosphere,whichindicatedthatrecombinantDNAfragmentscon－growthstagesshowedthetrendasfollows：

centratedintherhizoplanesoil,followedbytherhizospheresoilandnon-rhizospheresoil.Duringthe60dgrowthperiod,thecopynumberofthe35S-Cry1Aand35S-nptⅡfragmentsincreasedwiththegrowingstages,andthedistributionareasgraduallyexpanded.Thecopynumberof35S-nptⅡfragmentwashigherthan35S-Cry1Afragmentinthesamegrowthstageandinthecorrespondingrootzone.Transgenicinsect-resistantcottonmayhavepotentialimpactontheenvironment.

Keywords：transgenicinsect-resistantcotton;recombinantDNA;realtimePCR;rhizoboxmethod;distribution

国际农业生物技术应用服务组织（ISAAA）公布

的最新数据表明，到2011年，全球转基因作物的播种面积将达到1.6亿hm2，种植面积增长近94倍，种植转基因作物的国家从最初的6个将增加到29个[1]。随着转基因作物的大面积推广和种植，农业生产方式产生了巨大变革，经济效益得到大幅度提高，但与此同时，转基因作物对生态环境的潜在安全风险引起了国际上的广泛关注[2]。

目前研究发现转基因作物释放的外源重组DNA可能对生态系统造成潜在的影响，特别是土壤生态环

ep－境[3]。转基因作物所转入的外源基因（如Bt基因、

sps基因和nptⅡ基因）与微生物所携带的相关基因具有近缘关系，它们可通过植物根系分泌物、花粉、残体等方式释放到土壤环境中[4-5]，并可能被具有自然感受能力的微生物通过同源重组方式整合到基因组中，尤其是抗性筛选标记基因片段，这种基因水平转移很可能造成微生物群体结构和功能的改变，甚至造成微生态环境的改变，其生态安全性已经引起科学界的广泛关注[6-10]。

转基因抗虫棉花是我国种植面积最广的转基因2011年种植面积达到390万hm2，占棉花总种作物，

植面积的71.5%。我国所种植的转基因抗虫棉花是通过导入外源抗虫基因（Bt基因等），并以nptⅡ基因作为抗性筛选标记基因而选育的[11]。随着转基因抗虫棉花的大面积环境释放，其环境风险日益受到人们的重视。目前已开展大量关于转基因抗虫棉花环境风险性的研究，主要在对农田非靶标害虫、天敌及其他种类昆虫的影响[12]，对土壤微生物多样性的影响[13-14]，外源蛋白的残留情况及动态变化[15-19]，向叶围微生物的基因转移[11]及基因扩散[20]等方面，但对土壤环境中转基因抗虫棉花重组DNA的分布与动态变化缺乏研究。本研究针对转基因抗虫棉花中与苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因和新霉素磷酸转移酶基因具有

（c）和nptⅡ基因，根据其构建特异近缘关系的Cry1A

性序列设计引物和探针，建立荧光定量PCR方法，并

结合根盒法对3个生长时期不同根区土壤中35S-Cry1A和35S-nptⅡ片段进行定量分析，首次对转基因抗虫棉花重组DNA在土壤中的时空分布变化进行探索，丰富转基因抗虫棉花环境风险研究内容，为科学评价转基因抗虫棉花的生态安全性提供理论依据。

1材料和方法

1.1供试材料

供试棉花品种为转基因抗虫棉花SGK321，由中国农业科学院植物保护研究所提供。供试土壤为潮土，取自中国农业科学院武清转基因生物农田生态环境影响野外科学观测试验站，试验前种植玉米和小

kg-1，麦。部分理化性质如下：有机质含量10.69g·全

kg-1，kg-1，氮含量0.63g·全磷含量1.35g·硝态氮含量

36.38mgkg-1，kg-1。·铵态氮含量5.72mg·1.2根盒设计

试验中用于种植棉花的3室根盒由非透明有机玻璃加工制成，，长13cm、宽8cm、高12cm，植物生长

2个土壤室宽度均为5cm。植物生长室宽度为3cm，

室和2个土壤室之间用30μm孔径的尼龙网相隔，将根系限制在植物生长室中生长，采集土壤样品时便于将植物根系与土壤分离开（图1）。播种前将取自试验站的新鲜土壤自然风干，过1mm筛后装入各根室，每盒装土1.2kg。

1.3试验设计及土壤样品采集

试验在网室内进行，于2010年5月30日播种，共12盒，每盒播种3粒，待出苗后定苗至1株。播种后第10d以（NH4）2SO4和KH2PO4混合液体的形式

kg-1、kg-1、施一次肥，施氮200mg·磷150mg·钾188mgkg-1，·日常管理过程中不喷洒农药，用称重法补充

水分，使土壤含水量保持在17%左右。液体肥料与水均添加至植物生长室中。

50d和60d于棉花3个生长期（播种后40、）采

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