绵羊毛囊皮质层特异表达基因KAP11.1上游调控序列研究
本文选题：绵羊KAP11.1 + 皮质层 ； 参考：《华中农业大学》2017年硕士论文
【摘要】：在毛囊的形成过程中,毛母质细胞向上分化成内根鞘及毛干,毛干最后长出体表形成毛发。毛干由髓质层、皮质层、角质层三部分组成,皮质层是毛干的重要组成部分。绝大部分角蛋白关联蛋白(Keratin associated protein,KAP)基因在皮质层特异表达,KAPs含量及与角蛋白互作形成的交联结构影响毛发的理化性质,进而决定毛发的品质。本课题组前期研究发现绵羊角蛋白关联蛋白11.1(Keratin associated protein 11.1,KAP11.1)基因在毛囊皮质层特异表达,随后利用转基因小鼠模型证实绵羊KAP11.1基因5’端上游5952bp序列能够驱动外源基因在小鼠毛囊皮质层特异性表达。但KAP11.1基因在毛囊皮质层特异表达的调控机制尚不清楚。本研究通过生物信息学预测、双荧光素酶报告基因检测、点突变、RNA干扰、EMSA、免疫荧光组化等技术对绵羊KAP11.1基因上游调控序列进行了鉴定,并构建了表达Cre重组酶的KAP11.1-Cre转基因载体,主要研究结果如下:(一)绵羊KAP11.1基因5’端上游调控序列研究1.绵羊KAP11.1基因5’端上游序列中存在重要调控区域首先,对KAP11.1基因5’端2576bp上游序列(ATG的A为+1)进行截短,共得到7个截短体,分别命名为F5(-2576~+1)、F6(-2099~+1)、F7(-1594~+1)、F8(-1026~+1)、F9(-569~+1)、F10(-251~+1)、F11(-148~+1)截短体。将各截短体克隆到双荧光素酶报告载体并转染HEK293T细胞,检测结果显示F10截短体中可能存在影响绵羊KAP11.1基因表达的调控序列。通过生物信息学预测发现F10截短体中的-251~-148bp区域存在三个与毛囊发育相关的转录因子(Hoxc13、Tst-1/Oct6和Ets1)结合位点。其次,通过对预测的转录因子结合位点进行点突变、利用RNA干扰技术在体外细胞中抑制Hoxc13、Tst-1/Oct6、Ets1表达的策略证实这些结合位点对KAP11.1基因的表达具有调控作用。2.绵羊KAP11.1基因上游-251~-148bp区域与候选转录因子存在互作依据-251~-148bp区域中Hoxc13、Tst-1/Oct6和Ets1结合位点设计探针,利用凝胶电泳迁移实验(EMSA)验证三个转录因子与结合位点的互作,结果发现包含Hoxc13、Tst-1/Oct6和Ets1三个转录因子结合位点的序列与核蛋白形成了DNA-蛋白复合物,表明存在相互作用。3.绵羊KAP11.1基因上游-251~-148bp区域可能是一个重要的转录调控区域首先,采集毛囊处于生长期的绵羊及昆明小鼠皮肤制作切片,用免疫荧光组化技术检测显示Hoxc13、Tst-1/Oct6和Ets1在绵羊及小鼠毛囊皮质层有表达。其次,本课题组前期研究中制备了用绵羊KAP11.1基因5’端上游5952bp序列驱动KAP13.1和ZSG表达的pKAP11.1-sKAP13.1-2A-ZSG小鼠(简称Plus小鼠)。本研究采集了出生后9(毛囊生长期)、15(毛囊生长末期)、18(毛囊衰退期)、21(毛囊退行期)天的Plus小鼠皮肤制作切片,免疫荧光组化结果表明Hoxc13、Tst-1/Oct6和Ets1在毛囊生长期的Plus小鼠毛囊皮质层中高表达,在衰退期及休止期不表达或低表达,其时空表达模式与课题组前期研究中检测的由绵羊KAP11.1基因5’端上游5952bp序列调控的KAP13.1表达模式一致。第三,对绵羊KAP11.1基因5’端上游5952bp序列中-251~-148bp区域的Ets1转录因子结合位点进行点突变,插入双荧光素酶报告载体,检测结果发现KAP11.1基因5952bp上游序列的荧光素酶活性显著降低,说明-251~-148bp区域可能是KAP11.1基因上游序列中的一个转录调控区域。(二)表达Cre重组酶的KAP11.1-Cre转基因载体的构建利用本课题组前期研究中鉴定的可驱动外源基因在毛囊皮质层特异表达的绵羊KAP11.1基因5952bp上游序列,构建了表达Cre重组酶的KAP11.1-Cre载体并在三种细胞(HEK293T、BHK21和PK15)中超表达,在细胞水平进行了表达检测,已经用于KAP11.1-Cre转基因小鼠的制备。
[Abstract]:In this study , we identified the specific expression of KAP11 . 1 gene at 5 ' end of sheep KAP11.1 gene . The expression pattern of KAP11.1 - sKAP13.1 - sKAP13.1 - 2A - ZSG ( abbreviated Plus mouse ) , which was identified in the previous study of sheep KAP11.1 gene , was constructed .
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S826
【参考文献】
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，本文编号：1785717
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