猪传染性胃肠炎病毒M基因酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定

发布时间：2018-04-26 21:40

  本文选题：猪传染性胃肠炎病毒 + M蛋白　； 参考：《西南大学学报(自然科学版)》2017年09期

【摘要】：筛选与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)M蛋白相互作用的宿主蛋白,构建M蛋白的诱饵载体pGBKT7-M.首先利用PCR技术从重组表达载体pFastBacTM-M中扩增得到M基因,定向克隆至载体pMD19-T simple,验证正确后克隆至酵母双杂交系统诱饵表达载体pGBKT7,经双酶切、PCR反应及测序验证其正确插入后,利用PEG/LiAc法将构建好的重组诱饵载体pGBKT7-M及空载体pGBKT7分别转化到酵母Y2HGold感受态细胞中,检测其对酵母菌株是否有毒性作用和自激活活性及诱饵蛋白在酵母细胞内的表达情况.结果表明:扩增得到M基因738bp,成功构建了诱饵表达载体pGBKT7-M,此诱饵载体对酵母细胞无细胞毒性和自激活活性.Western blot检测到5×104左右的蛋白条带,显示诱饵蛋白在酵母细胞内稳定表达.
[Abstract]:The host protein interacting with TGEV M protein of porcine infectious gastroenteritis virus was screened and the bait vector pGBKT7-M was constructed. M gene was amplified from the recombinant expression vector pFastBacTM-M by PCR technique and cloned into the vector pMD19-T simple. and then cloned into yeast two-hybrid system bait expression vector pGBKT7. After double enzyme digestion and sequencing, the M gene was cloned into the vector pGBKT7. The recombinant decoy vector pGBKT7-M and empty vector pGBKT7 were transformed into yeast Y2HGold receptive cells by PEG/LiAc method, and the toxicity, self-activation activity and the expression of bait protein in yeast cells were detected. The results showed that the bait expression vector pGBKT7-Mwas successfully constructed by amplification of the M gene 738bp. the decoy vector had no cytotoxicity and self-activating activity. The protein bands of about 5 脳 10 ~ 4 were detected by Western blot, which showed that the bait protein was stably expressed in yeast cells.
【作者单位】： 西南大学(荣昌校区)动物医学系;
【基金】：重庆市前沿与基础研究项目(cstc2014jcyjA80015) 重庆市研究生科研创新项目(CYS14057,CYS2015076)
【分类号】：S852.651

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本文编号：1807834