淋病奈瑟菌WHO-A株Cas基因表达与功能初步研究

发布时间：2018-05-02 13:31

  本文选题：淋病奈瑟菌 + CRISPR系统　； 参考：《扬州大学》2017年硕士论文

【摘要】：淋病是全球发病率最高的性传播疾病之一,淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae,Ng)是淋病的病原体。淋病奈瑟菌感染可导致不孕不育,还可促进人类免疫缺陷病毒(HIV)的传播。随着抗生素使用种类的更新,淋病奈瑟菌耐药性范围也不断扩增,给淋病治疗带来极大难度。为此亟需全面了解淋病奈瑟菌的生物学特性,以利于从根本上控制淋病。近年发现约90%古细菌和40%真细菌基因组中存在CRISPR系统,由CRISPR簇、前导序列(Leader)以及一系列CRISPR相关蛋白(Cas)基因构成,为细菌防御噬菌体和外源基因的侵袭发挥重要作用,是细菌的获得性免疫系统。课题组前期分析淋病奈瑟菌WHO-A株基因组信息发现6个CRISPR簇和2个分别属于CT1133家族和TM1801家族的Cas基因(下文分别称CT和TM),本研究检测了淋病奈瑟菌WHO-A株Cas基因的表达,并对其功能进行了初步探究。研究内容分为以下四个部分:一、淋病奈瑟菌Cas基因的类型分析与原核表达载体构建目前至少报道了 45个Cas基因家族,为了分析淋病奈瑟菌WHO-A株Cas基因的类型,对WHO-A株的两个Cas基因进行BLAST分析,与已公布的相关基因进行同源性比较。为研究淋病奈瑟菌中CRISPR系统中Cas蛋白的结构和功能,根据前期WHO-A株基因组序列测定结果确定其Cas基因的具体位置并设计引物。为将CT或TM基因均分别插入pCold-TF和pGEX-6p-1中,上下游引物两端分别添加有Pst Ⅰ和KpnⅠ以及Bam HⅠ和Xho Ⅰ酶切位点。提取淋病奈瑟菌WHO-A株总DNA为模板,PCR扩增Cas基因。扩增产物和载体使用相同双酶切处理,酶切产物分别纯化回收后用T4连接酶连接,构建Cas基因原核表达载体。二、重组Cas蛋白的原核表达和多克隆抗体制备将原核表达载体pCold-CT(TM)和pGEX-CT(TM)分别转化至大肠埃希菌BL21(DE3),得到的重组菌用IPTG作可溶性表达的小量诱导,经SDS-PAGE检测到分子量与预期大小一致的表达产物后,用同样方法进行大量诱导,取pCold-CT(TM)-BL21和pGEX-CT(TM)-BL21的上清分别通过镍亲和层析柱和谷胱甘肽树脂柱,纯化产物CT(TM)-His和CT(TM)-GST用SDS-PAGE作分子量分析,并用BCA试剂盒检测目的蛋白的含量。用纯化的CT(TM)-His融合蛋白免疫BALB/c小鼠,4w后收集血清,以CT(TM)-GST融合蛋白为抗原检测免疫血清中特异性抗体的效价。结果表明,获得了符合预期大小的CT和TM重组蛋白,间接ELISA检测表明小鼠免疫血清中的CT和TM抗体的效价分别为1:25600和1:12800。制备的特异性抗体为检测淋病奈瑟菌WHO-A株细胞内相应Cas蛋白的表达和研究蛋白功能提供了实验材料。三、淋病奈瑟菌WHO-A株Cas基因的表达分析为检测淋病奈瑟菌WHO-A株中Cas基因的转录和表达情况,我们用RT-PCR法、ELISA法和免疫荧光法3种方法分别检测了细菌细胞内的Cas-mRNA和Cas蛋白。(1)提取该菌总RNA为模板,通过RT-PCR法转录获得cDNA,用Cas基因引物对cDNA进行PCR扩增,产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析;(2)对WHO-A株细菌作超声裂解处理,取裂解液为抗原,以制备的Cas抗体为第一抗体,棋盘滴定法检测裂解菌液中Cas蛋白的存在情况;(3)将WHO-A株细胞用4%多聚甲醛固定于载玻片上,以CT(TM)血清抗体作为一抗,以FITC标记的羊抗鼠IgG作为二抗进行免疫荧光实验,荧光显微镜下检测样品的发光情况。结果表明,从WHO-A株总RNA中用RT-PCR可扩增出与CT或TM基因大小一致的DNA条带;WHO-A株细菌超声裂解液包被量为200 pg/ml时,以1:12800的CT多抗和1:800的TM多抗可以检测到相应Cas蛋白表达的明显信号;WHO-A株细菌细胞固定后用CT或TM抗体可检测到特异性荧光。以上结果提示Cas基因在淋病奈瑟菌WHO-A株细胞中可进行有效转录与表达,淋病奈瑟菌的CRISPR系统可能是一个具有活性的完整系统,为此需进一步研究Cas蛋白的结构与功能。四、淋病奈瑟菌WHO-A株Cas蛋白功能的初步研究实验室前期已构建pCas9-KRn重组载体,即一种靶向卡那霉素抗性基因的CR]ISPR简化系统,可作为Cas蛋白核酸酶活性的研究工具。为探究CT或TM蛋白是否发挥核酸酶活性,将pCas9-KRn中的Cas9基因替换为CT或TM基因。以pCas9-KRn中Cas9以外的部分为模板设计引物并进行PCR扩增,扩增产物两端分别添加了PstⅠ、Kpn Ⅰ酶切位点,双酶切并纯化后与相同酶切处理的CT或TM基因连接,获得重组质粒pCT(TM)-KRn,转化宿主大肠埃希菌后分别用RT-PCR和ELISA两种方法检测到WHO-Cas基因的表达。pCT(TM)-KRn转化至含pET-30a的DH5α大肠埃希菌,用LB培养液对重组菌进行传代。每代菌液分别在卡那霉素和氯霉素LB平板上的活菌计数结果表明,二者的CFU值没有明显差异,提示未发现WHO-Cas蛋白的核酸酶活性,其作用机制可能与Cas9蛋白的核酸酶活性具有较大差别。
[Abstract]:In recent years , we have found that there are six CRISPR clusters and two genes of CRISPR . In recent years , we have found that there are 6 CRISPR clusters and two genes of CRISPR . The recombinant plasmid pCas9 - KRn was amplified by RT - PCR . The results showed that the recombinant plasmid pCas9 - KRn was used as the first antibody , and then the recombinant plasmid pCT ( TM ) - KRn was used as the first antibody . The recombinant plasmid pCT ( TM ) - KRn was transformed into DH5.alpha . E . coli containing pET - 30a .

【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R378

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 林秀凤,邱华红;204株淋病奈瑟菌药敏结果分析[J];海峡药学;2000年02期

2 杨仁江,刘正文,戴雪峰;130株淋病奈瑟菌药敏结果[J];四川省卫生管理干部学院学报;2000年S1期

3 刘金波,林国英,董友志;淋病奈瑟菌的3种检测方法[J];中华男科学;2001年06期

4 魏荣旋 ,王和;cppB基因PCR检测淋病奈瑟菌稳定L型的评价[J];贵州医药;2003年01期

5 郭德芝;;淋病奈瑟菌461例聚合酶链反应检测分析[J];江西医学检验;2005年06期

6 乔伟振;李琴;姚亮;谢平;;咽部感染淋病奈瑟菌22例[J];临床耳鼻咽喉头颈外科杂志;2007年15期

7 钱忠富,陈小秀;从腹腔脓液中分离出一株淋病奈瑟菌[J];上海医学检验杂志;1997年04期

8 李庆端;改良前列腺液涂片检查淋病奈瑟菌[J];上海医学检验杂志;1999年05期

9 文军;119例淋病奈瑟菌药敏分析[J];川北医学院学报;1999年02期

10 吕火祥,沈蓓琼,许立,刘建栋;微量生化反应快速鉴定淋病奈瑟菌[J];中国皮肤性病学杂志;2000年01期

相关会议论文 前8条

1 陈群英;;118株淋病奈瑟菌的检测及药敏结果分析[A];2004年浙江省检验医学学术会议论文汇编[C];2004年

2 糜祖煌;黄瑞萍;郑亚芬;;淋病奈瑟菌5种抗生素耐药遗传学研究[A];第6次全国微生物学与免疫学大会论文摘要汇编[C];2004年

3 王劲松;季明春;李国才;潘兴元;朱立天;;人CD46基因启动子的克隆与验证[A];中国免疫学会第五届全国代表大会暨学术会议论文摘要[C];2006年

4 李国明;陈群;陈军剑;樊翌明;;淋病奈瑟菌耐药基因型与多重耐药关系的研究[A];第6次全国微生物学与免疫学大会论文摘要汇编[C];2004年

5 王劲松;蒋桂花;潘兴元;朱立天;李国才;季明春;;人CD46 cDNA的克隆及其功能的初步研究[A];中国免疫学会第五届全国代表大会暨学术会议论文摘要[C];2006年

6 许少涵;兰小鹏;;体外SELEX法筛选淋病奈瑟菌适体[A];华东六省一市第八次皮肤性病学术会议论文汇编[C];2007年

7 王劲松;季明春;李国才;潘兴元;朱立天;;hCD46基因启动子指导hCEACAM1 cDNA在CHO细胞的表达[A];中国免疫学会第五届全国代表大会暨学术会议论文摘要[C];2006年

8 王劲松;季明春;李国才;潘兴元;朱立天;;自身启动子指导人CD46 cDNA在CHO细胞的表达[A];中国免疫学会第五届全国代表大会暨学术会议论文摘要[C];2006年

相关博士学位论文 前3条

1 陶小华;我国淋病奈瑟菌头孢曲松耐药趋势及运用比较蛋白质组学研究其部分耐药机制[D];中国协和医科大学;2009年

2 李赛;淋病奈瑟菌耐药流行病学监测和依赖ID0-1的免疫调节机制研究[D];北京协和医学院;2015年

3 陈强;淋病奈瑟菌opa基因分型研究及其流行病学应用[D];中国协和医科大学;2007年

相关硕士学位论文 前10条

1 冒艳丽;淋病奈瑟菌CRISPR系统的生物信息学分析与克隆[D];扬州大学;2015年

2 高洁;淋病奈瑟菌外膜蛋白反向候选疫苗的初步实验筛选[D];大理大学;2016年

3 杨慧;沙门菌菌影负载的淋病奈瑟菌PorB基因疫苗的实验研究[D];扬州大学;2016年

4 徐桐桐;淋病奈瑟菌CRISPR簇与自身靶基因间相互作用的初步研究[D];扬州大学;2017年

5 赵立红;实时荧光定量PCR检测临床标本中淋病奈瑟菌[D];青岛大学;2002年

6 朱立天;淋病奈瑟菌表面蛋白A和孔蛋白B免疫保护性研究[D];扬州大学;2008年

7 侯临平;临汾地区淋病奈瑟菌临床分离株对环丙沙星耐药基因研究[D];山西医科大学;2008年

8 贺超;淋病奈瑟菌主要外膜蛋白PⅠA真核表达载体的构建及免疫作用研究[D];华中科技大学;2006年

9 王小红;淋病奈瑟菌粘附因子受体hCEACAM1转基因小鼠模型的建立及初步应用[D];扬州大学;2009年

10 路荣忠;淄博地区淋病奈瑟菌临床分离株对环丙沙星的耐药性及parC基因突变的检测[D];青岛大学;2005年

，

本文编号：1834143