miR-664下调靶基因FOXO4促进骨肉瘤细胞恶性增殖及机制研究

发布时间：2018-05-03 21:29

本文选题：骨肉瘤 + miR-664　；参考：《南方医科大学》2016年博士论文

【摘要】：研究背景骨肉瘤是最常见的原发性恶性骨肿瘤,是来源于胚胎间叶组织的恶性程度很高的实体性肿瘤。大多数骨肉瘤为原发性肿瘤,只有少部分为继发性,好发部位位于血运丰富的四肢骨的干骺端,以下肢股骨远端和胫骨近端最常见,其次是肱骨和腓骨近端。骨肉瘤多为溶骨性改变,少数为成骨性改变,骨肉瘤组织中含有不同成分的骨软骨、纤维结缔组织及增生骨样骨组织。骨肉瘤病理学特点是肿瘤组织能产生高度恶性梭形基质细胞,并形成骨样组织,肿瘤细胞还可以直接成骨和产生骨基质,可浸润扩散至骨皮质及髓腔。目前也有新的研究表明,骨肉瘤的恶性肿瘤细胞并非完全来自于骨基质细胞,骨间质的多能干细胞恶性增殖也能导致骨肉瘤的发生。骨肉瘤发病率在原发性恶性骨肿瘤中占据首位,骨肉瘤发病年龄多在15～25岁,发病率为4.5/100万,在美国每年新发的骨肉瘤患者约为900例。骨肉瘤多早期远处转移,而且发展迅速,其转移率及病死率非常高。单纯行截肢治疗或行保肢手术及肿瘤型假体置换手术无法有效控制肿瘤的转移,患者常在短期内死于肿瘤肺转移,如何治疗骨肉瘤肺转移成为骨肉瘤治疗中面临最重要问题之一。随着治疗手段的不断提高,目前采用新辅助化疗加保肢手术等综合性治疗已经成为治疗骨肉瘤的主要方式,可有效提高患者的短期生存率,对骨肉瘤的治疗已经取得了明显进步。美国癌症中心的数据显示骨肉瘤患者的5年生存率平均约为53.9%,随着手术及新辅助化疗等技术的快速发展,未发生转移的骨肉瘤患者5年生存率提高到70%左右,但对骨肉瘤转移及复发等问题仍然没有得到有效解决,伴有肺部转移的骨肉瘤患者短期生存率没有明显提高。很大部分骨肉瘤患者,在初步诊断为骨肉瘤时,已经在肺部发生了无症状或者症状轻微(仅表现为不明原因咳嗽)的转移,其他部分转移如肝,肾等部位转移普遍存在。任何类型的肿瘤,包括骨肉瘤一旦发生远处器官的转移,意味着预后不佳,即便多手段联合治疗,患者的其5年生存率不会高于30%。骨肉瘤对患者本人、家庭乃至社会造成巨大的痛苦及经济压力。虽然越来越多的治疗开始向分子遗传学和分子生物学方面靠近,从基因及干细胞角度去尝试治疗肿瘤病变是将来医学的发展方向。目前肿瘤的治疗包括介入治疗、免疫治疗、干细胞移植等多中手段,为恶性肿瘤的治疗提供了可靠而安全的治疗。相比过去尽管骨肉瘤的治疗取得了长足的进步,但是仍然没有取得理想的突破性进展。在其治疗中仍然存在许多难以解决的问题,如中晚期远处器官转移、肿瘤原发病灶再发性和转移性骨肿瘤尚无疗效乐观的的靶向治疗方式。如何实现骨肉瘤的早发现、早诊断、早治疗及预防骨肉瘤转移有关键性意义。因此尽早发现骨肉瘤及预防其恶性增殖成为目前尚需迫切解决的问题。由于正常细胞原癌基因突变为癌基因,肿瘤细胞获得了理论上无限增殖的能力。肿瘤的恶性增殖直接导致了肿瘤切除后局部残留或者远处转移的肿瘤细胞再度增殖复发的可能,临床上对此尚无理想的对策。研究表明肿瘤的产生不是一蹴而就的简单过程。细胞的单克隆学说理论中指出,一旦细胞发生基因的点突变或者缺失突变后,极易导致原癌细胞的癌变,细胞不仅仅获得分裂的能力,同时获得了分裂速度的质变。当外周环境包括内环境和外环境条件合适,营养充分的条件下,肿瘤细胞可以突破本身局限,向周围组织侵犯和转移,实现肿瘤的远处转移。很多转移性肿瘤不一定能找到原发病灶,临床上称之为“微小转移癌”,指的就是微小细胞组成的癌团,转移侵犯往往大于增殖速度,导致肿瘤薄膜不明显,局部无特征性影像学改变。研究者尝试从分子及基因角度去阐明肿瘤增殖的机制,试图寻找肿瘤增殖的分子标记物以及治疗靶标,特别是在外周体液及血液中能够检测出的分子标记物,为早期治疗、早期预防提供有效而快捷的途径,也是目前肿瘤研究的最大难题之一。S期细胞分裂周期缩短,分裂时象增加,G1期细胞分裂周期延长,分裂时象减少,G1/S比例倒置以及细胞周期调控点失平衡,是肿瘤细胞增殖分裂的细胞学特征。主要分子机制是促癌基因及蛋白表达增加,比如周期蛋白CyclinD1,CyclinA等,而有抑癌作用的基因及蛋白表达含量降低,比如周期蛋白依赖性激酶抑制因子p21家族。如何控制细胞增殖,调控细胞G1/S分裂速度,并维持细胞周期调控点平衡是治疗肿瘤的关键。越来越多的研究关注与细胞增殖事件所涉及到的基因、分子通路,并努力寻找肿瘤标记物,便于临床诊断治疗。因此阐明调节肿瘤细胞增殖事件的分子机制,探寻引起细胞周期转换的原因,甚至寻找阻断肿瘤增殖发生的靶位点,将对于多种恶性肿瘤预防和药物研制具有重要指导意义。MicroRNA (miRNA)是近年来新发现的一类约20-25nt的非编码小RNA分子。越来越多的研究发现,miRNA参与生物多种重要生命活动：调控细胞生长、分化、增殖、粘附、监视、凋亡；调节组织构造、平衡、识别。miRNA被誉为是“生物学中的暗物质,存在于我们周围却几乎逃脱了所有的视线”,中心法则中RNA已经不是次要的中介角色。MicroRNA可通过与靶基因mRNA结节调节其转录水平。人类遗产基因库已发现1000余种人体相关miRNA。 miRNA在物种进化中相当保守,在植物、动物和真菌中发现的miRNA只在特定的组织和发育阶段表达,miRNA的组织特异性和时序性,决定组织和细胞的功能特异性,表明miRNA在细胞生长和发育过程中起多种调节作用。大多数miRNA的基因位于非编码区,只有少数位于编码区,一般独立存在,少部分成簇状排列,簇状排列的多个基因具有协同表达的特点。miRNA与多种肿瘤的发生发展紧密相关。miRNA既可作为癌基因,下调抑癌基因的活性；也可作为抑癌基因,下调原癌基因的活性。Esquela-Kerscher总结既往和现有肿瘤相关miRNA的研究,认为miRNA与多种恶性肿瘤的发生发展紧密相关,并提出"oncology microRNAs"(肿瘤MicroRNA)的新概念,开辟了将miRNA应用于肿瘤学相关研究的新篇章。多种miRNA的突变或含量变化与恶性骨肿瘤骨肉瘤的发生、恶化及迁徙密切相关。插头转录因子(FOXO)能够抑制肿瘤生长、限制细胞增殖和诱导细胞凋亡,FOXO表达与人类癌症如横纹肌肉瘤、骨肉瘤、白血病和淋巴瘤等相关。phosphatidylinositol-3激酶通路中FOXO相关蛋白质灭活是主要致癌信号,多种miRNA通过抑制FOXO基因导致细胞癌变。FOXO做为抑癌因子能够为肿瘤带来新的治疗方法,FOXO的下游靶基因是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B(PKB)/ Akt蛋白激酶能够抑制转录功能调节细胞生存、生长和增殖,可为肿瘤带来新的治疗方法。新证据表明FOXO参与不同的胞内信号通路并可能是许多生理和病理状态包括癌症的关键角色,FOXO与这些信号通路交互影响,并参与其他胞内蛋白磷酸化及转录后修饰。FOXO通过诱导表达多个促癌Bcl2-family成员积极参与线粒体靶向蛋白刺激死亡受体配体如Fas配体和肿瘤坏死factor-related凋亡诱导配体(TRAIL),或提高水平的各种细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(CDKIs),抑制细胞生长和/或促进细胞凋亡。FOXO表达谱已被确定在数种人类癌症存在,并认为具有分子治疗的潜力。本研究将寻找与骨肉瘤发生发展相关性很高的miRNA作为研究对象,探寻其在癌症形成过程中的促癌或者抑癌作用,并尝试分析其靶基因及作用机理。目前有文章报道miR-664高表达于肝癌组织中且在肝癌中与MATA的表达相关。miR-664在乳头状甲状腺癌的淋巴结样本中低表达,miR-664心肌损伤病人中高表达。且这些研究仅仅是检测样本表达的情况,并没有对其功能及具体作用机制做出详细的探讨。我们在芯片平台的GSE39040芯片发现miR-664异常表达于骨肉瘤中,并通过Targetscan数据库对差异表达的靶基因进行预测,并将预测结果输入软件进行生物学通路分析,发现miR-664与FOXO4基因存在强相关性。以上仅仅为理论上猜测,MiR-664在骨肉瘤中的表达水平及其生物作用机制目前没有任何的相关文献报道。本课题在前期MicroRNA表达谱通过生物网络信息学方法,预测miR-664在骨肉瘤组织中过表达的基础上,以转染rniR-664 mimic、miR-664 inhibitor骨肉瘤细胞为模型,通过研究miR-664诱导细胞增殖的分子机制,探讨miR-664下调FOX04激活PI3K/AKT/FOXO信号通路从而调节p21, CyclinD1等信号分子的变化。通过验证过表达miR-664通过靶向结合FOXO4的3'UTR抑制FOXO4的翻译,进而诱导细胞快速增殖的假设提供直接证据及为治疗骨肉瘤提供新的分子靶点。本研究将分成三部分研究miR-664与骨肉瘤的相关性及下调FOXO4基因促进骨肉瘤细胞恶性增殖的机制。第一部分miR-664在骨肉瘤中的异常表达(一)miR-664在人体骨肉瘤病理组织中的表达实验目的：验证miR-664在人体骨肉瘤病理组织中的表达量实验方法：采集8例人体骨肉瘤病理组织和癌旁病理组织,通过实时荧光定量PCR的方法,采用Sybrgreen染料法,以U6为内参基因,对miR-664基因在人体骨肉瘤新鲜病理组织及及癌旁组织中的表达量进行对比检测。实验结果：8例骨肉瘤组织中miR-664相对于U6的平均表达水平为1.807,8例骨肉瘤癌旁组织中的miR-664相对于U6的平均表达水平为0.038,相差47.55倍(p0.05)。实验结论：miR-664在骨肉瘤病理组织中高表达。(二)miR-664在体外骨肉瘤细胞株中的表达实验目的：验证miR-664在人体骨肉瘤细胞中的表达量实验方法：通过实时荧光定量PCR的方法,采用Sybrgreen染料法,以U6为内参基因,对miR-664基因在SOSP-9607、U2-OS、SAOS-2、HOS、MG-63及人正常成骨细胞株hFOB1.19的表达量进行对比检测。实验结果：相较于对照组hFOB1.19细胞株,miR-664在5种骨肉瘤细胞株中均特异性地表达上调(P0.05),其中以MG-63(26.383)最高,SAOS-2(19.343)次之,U2-OS (16.553) HOS (11.577)居中,SOSP-9607 (9.633)最低。实验结论：miR-664在5组体外骨肉瘤细胞中均呈高表达,并根据5组骨肉瘤细胞株的miR-664的表达,选取U2-OS骨肉瘤株作为转染对象及实验平台。第二部分miR-664表达失调对U2-OS骨肉瘤细胞恶性增殖的影响(一)过表达miR-664促进U2-OS骨肉瘤细胞恶性增殖作用实验目的：研究过表达miR-664对于U2-OS骨肉瘤细胞恶性增殖的影响。实验方法：以脂质体转染miR-664 mimic及NC对照的U2-OS骨肉瘤细胞为模型,通过1、实时荧光免疫PCR检测miR-664 mimic瞬时转染后骨肉瘤细胞miR-664的表达；2、MTT比色法技术检测骨肉瘤细胞增殖速度；3、细胞克隆实验检测骨肉瘤细胞增殖能力；4、软琼脂克隆实验(Soft agar assay)检测癌细胞非锚定生长的恶性化能力；5、BrdU渗入法(5-溴脱氧尿嘧啶核苷法)技术检测miR-664对细胞分裂周期的调控。实验结果：1、转染miR-664 mimic后,miR-664的表达增高了16.192倍(P0.05)；2、MTT比色法实验：miR-664 mimic组骨肉瘤细胞增殖速度(10.822)明显高于对照组(P0.05)；3、细胞克隆实验：miR-664 mimic组骨肉瘤细胞增殖能力明显高于对照组(P0.05)；3、软琼脂克隆实验：miR-664 mimic组骨肉瘤细胞非锚定生长的恶性化能力明显高于对照组(P0.05)；4、BrdU渗入法实验：miR-664 mimic组S期骨肉瘤细胞明显高于对照组(P0.05)。实验结论：过表达miR-664明显促进U2-OS骨肉瘤细胞增殖速度、增殖能力及恶性分裂。(二)抑制miR-664抑制U2-OS骨肉瘤细胞恶性增殖作用实验目的：研究下调miR-664对于U2-OS骨肉瘤细胞恶性增殖的影响实验方法：以脂质体转染miR-664 inhibitor及NC对照的U2-OS骨肉瘤细胞为模型,通过1、实时荧光免疫PCR检测niR-664 inhibitor瞬时转染后骨肉瘤细胞miR-664的表达；2、MTT比色法技术检测骨肉瘤细胞增殖速度；3、细胞克隆实验检测骨肉瘤细胞增殖能力；4、软琼脂克隆实验(Soft agar assay)检测癌细胞非锚定生长的恶性化能力；5、BrdU渗入法(5-溴脱氧尿嘧啶核苷法)技术检测miR-664对细胞分裂周期的调控。实验结果：1、转染miR-664 inhibitor后,miR-664的表达降低至0.128倍(P 0.05); 2、MTT比色法实验：miR-664 inhibitor组骨肉瘤细胞增殖速度明显低于对照组(P0.05)；2、细胞克隆实验：miR-664 inhibitor组骨肉瘤细胞增殖能力明显低于对照组(P0.05)；3、软琼脂克隆实验：miR-664 inhibitor组骨肉瘤细胞非锚定生长的恶性化能力明显低于对照组(P0.05)；4、BrdU渗入法实验：miR-664 inhibitor组S期骨肉瘤细胞明显少于对照组(P0.05)。实验结论：下调miR-664表达明显抑制U2-OS骨肉瘤细胞增殖速度、增殖能力及恶性分裂。第三部分miR-664下调FOXO4促进U2-OS骨肉瘤细胞恶性增殖(一)探讨miR-664对FOXO4信号途径的作用实验目的：研究促进骨肉瘤细胞恶性增殖内在分子机制是否通过FOXO4信号途径调节。实验方法：以转染miR-664 mimic及miR-664 inhibitor U2-OS细胞为模型,通过免疫印迹法检测FOXO4基因蛋白表达水平,并利用实时定量PCR及免疫印迹法检测FOXO4靶基因P21、Rb、p-Rb、CyclinDl的mRNA及蛋白质表达情况。实验结果：1、在免疫印迹法检测中,FOXO4在miR-664 mimic U2-OS细胞中的表达降低,而在miR-664 inhibitor U2-OS细胞中的表达增高(P0.05)。2、同样的,FOXO4靶基因p21、p-Rb在miR-664 mimic U2-OS细胞中的表达降低,而在miR-664 inhibitor U2-OS细胞中的表达增高(P0.05)。3、而细胞周期蛋白CyclinDl基因表达与FOX04相反：在miR-664 mimic U2-OS细胞中的表达增高,而在miR-664 inhibitor U2-OS细胞中的表达降低(P0.05)。实验结论：miR-664能抑制FOXO4及其靶基因p21、p-Rb的表达。(二)探讨miR-664对靶基因FOXO4靶向调控关系实验目的：确定miR-664对靶基因FOXO4的靶向调节作用实验方法：使用Targetscan软件工具寻找miR-664潜在靶基因,利用免疫印迹分析表明,在U2-OS骨肉瘤细胞对照组、miR-664 mimic组与miR-664inhibitor中FOXO4基因表达存在显著的差异性,mimic组蛋白表达低于对照组,而inhibitor蛋白表达高于对照组。为了进一步验证miR-664与FOXO4靶向调节关系,构建含有FOXO4-3'UTR荧光素酶报告质粒,将直接合成miR-664的rnutation转染到细胞中,采用脂质体转染法,在对照组、miR-664 mimic、miR-664 inhibitor、miR-664 mutation U2-OS细胞中共转染FOXO4-3'UTR荧光素酶报告质粒,48小时后裂解细胞,检测荧光素酶活性,确定miR-664对FOXO4-3'UTR的调节关系。实验结果：1、用Targetscan软件工具发现FOXO4是miR-664的靶基因；2、荧光素酶检测表明,FOXO4基因在对照组、miR-664 mimic、miR-664 inhibitorU2-OS细胞中,表达存在差异性(P0.05)；而在miR-664 mutation U2-OS细胞中却无此差异性。实验结论：FOXO4基因是miR-664的目标调控基因。(三)FOXO4基因是miR-664促进骨肉瘤恶性增殖的关键基因实验目的：研究FOXO4在骨肉瘤增殖中的关键作用。实验方法：为了进一步分析FOXO4在骨肉瘤增殖中的作用,通过特异性siRNA1#、2#阻断FOXO4基因的2个靶点抑制其内源性表达,在miR-664inhibitor U2-OS细胞中,通过MTT技术、克隆实验、软琼脂克隆实验、BrdU技术,观察U2-OS增殖速度、增殖能力及增殖恶性化程度。实验结果：1、通过特异性siRNA阻断FOXO4基因的2个靶点后,FOXO4在miR-664 inhibitor U2-OS细胞中的内源性表达成功被沉默(P0.05)。2、下调内源性FOXO4基因表达,U2-OS骨肉瘤细胞增殖速度、增殖能力及恶性分裂程度较对照组细胞明显增高(P0.05)。实验结论：FOXO4基因在miR-664促进U2-OS骨肉瘤细胞恶性增殖中起着关键作用。(四)骨肉瘤组织中miR-664与FOXO4表达相关性分析实验目的：分析临床骨肉瘤组织中miR-664与FOXO4表达相关性。实验方法：实时荧光免疫PCR检测8例骨肉瘤组织和癌旁组织中miR-664表达水平；Western-Blot检测8例骨肉瘤组织FOXO4表达水平。将二者做相关性分析。实验结果：统计学的结果显示miR-664的表达水平与FOXO4呈负相关的线性关系(r2=0.951,p0.05)。实验结论：进一步验证了miR-664的表达水平与临床上骨肉瘤的增殖呈正相关,而FOXO4的表达水平与其呈负相关性。通过以上三部分实验,我们可以得出本实验的结论,miR-664下调靶基因FOXO4促进骨肉瘤恶性增殖。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R738.1

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