梅花肌醇半乳糖苷和棉子糖合成酶基因的克隆与功能初探

发布时间：2018-05-04 17:54

  本文选题：梅花 + 肌醇半乳糖苷合成酶　； 参考：《华中农业大学》2017年硕士论文

【摘要】：梅(Prunus mume Sieb.et Zucc.)原产我国南方地区,冬季低温限制了其在北方地区的分布。棉子糖家族寡糖(Raffinose family oligosaccharides,RFOs)在植物体内的积累能够提高植物抵抗、适应逆境的能力,是植物细胞内重要的渗透调节物质,由蔗糖逐步叠加半乳糖基团合成。肌醇半乳糖苷合成酶(Galaetinol synthase,GolS)和棉子糖合成酶(Raffinose synthase,RS)是合成过程中的重要酶。为探索PmGolS和PmRS基因在响应非生物逆境胁迫中的功能,本研究从‘雪梅’中克隆得到了5个PmGolS基因(Pm003196、Pm006697、Pm008430、Pm012900、Pm020004)和2个PmRS基因(Pm027594、Pm025896),并构建了相应的超量表达载体;利用qRT-PCR检测了它们在昼夜和非生物逆境胁迫下的表达模式;异源转化拟南芥,鉴定转化植株在非生物逆境胁迫下的抗性;同时,转化梅花,获得了正常生根的转基因植株。主要结果如下:1.PmGolS和PmRS基因的克隆与序列分析根据‘雪梅’幼叶4℃低温处理下的基因表达谱和梅花基因组数据,克隆了5个PmGolS基因和2个PmRS基因。进化树分析发现:不同物种间GolS同源蛋白的近缘性高于同一物种内的不同GolS亚型,说明,物种进化可能发生在种内GolS基因序列复制事件之后;RS同源蛋白进化树的分析结果与GolS一致。氨基酸序列分析发现:PmGol S编码的蛋白质氨基酸序列高度保守,在第130个氨基酸左右都有锰结合元件DXD,在第270个氨基酸左右都有丝氨酸磷酸化位点,且羧基末端都有一个特征性的疏水性五肽(APSAA);而PmRS编码的蛋白质氨基酸序列保守性较低,但都具有KXD和RXXXD两个保守催化域。2.PmGolS和PmRS基因在昼夜及非生物逆境胁迫下的表达模式以‘雪梅’幼叶为材料,利用qRT-PCR技术,检测了5个PmGolS基因和2个PmRS基因昼夜及低温、干旱、高盐和ABA胁迫下的表达丰度变化,结果表明:PmGolS基因中Pm003196存在明显的昼夜表达规律,另外6个基因并无明显的昼夜表达规律;所有目的基因都不响应ABA胁迫,但对另外三个非生物逆境胁迫各有不同程度的响应,Pm003196、Pm006697、Pm025896响应低温胁迫,Pm008430、Pm027594、Pm025896响应NaCl胁迫,Pm003196、Pm008430、Pm025896、Pm027594响应甘露醇胁迫,Pm027594不响应低温胁迫,Pm012900、Pm020004在所有胁迫下表达量都很低。3.PmGolS蛋白亚细胞定位构建了PmGolS家族中的三个基因Pm003196、Pm008430、Pm006697相应的YFP融合蛋白表达载体,对其进行亚细胞定位分析。结果显示,三种蛋白均分布在细胞核、细胞质和细胞膜中。4.PmGolS和PmRS基因异源转化拟南芥及转化植株的抗寒性分析构建了5个PmGolS基因和2个PmRS基因的超量表达载体,并转化拟南芥。T1代拟南芥阳性苗RT-PCR分析结果显示,除Pm020004外,其它基因均获得高表达转化株系。对拟南芥T2代和野生型株系进行低温处理和电导率测定,结果显示:转PmGolS基因拟南芥株系的存活率和相对电导率与野生型株系没有明显差别;而转PmRS基因拟南芥株系的存活率比野生型株系高,且相对电导率比野生型株系低;此外,转Pm003196基因拟南芥高株系的种子在400mM甘露醇胁迫下的萌发率比野生型高。5.PmGolS转化梅花PmGolS基因超量表达载体转化梅花成熟胚子叶,共侵染262个外植体,得到了转Pm008430基因的抗性芽24个,转入伸长培养基后有15个抗性芽伸长至23澴笥，

本文编号：1844002