rAAV8介导的C基因型乙型肝炎病毒复制小鼠药物评价模型的建立及应用

发布时间：2018-05-05 08:11

本文选题：多重耐药 + 乙型肝炎病毒　；参考：《桂林医学院》2017年硕士论文

【摘要】：目的:慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是世界性的公共健康威胁,HBV感染可以导致慢性乙型肝炎甚至可以引起肝硬化和肝细胞癌。HBV主要分为A-J十种不同的基因型,中国北方以C基因型HBV感染流行为主。目前主要的治疗策略为干扰素治疗和核苷(酸)类似物(NAs)抗病毒治疗,近年来临床上耐核苷类药物和核苷酸类药物的多重耐药(multidrug-resistant,MDR)HBV感染呈逐年增多趋势,给临床治疗带来更大的挑战。HBV稳定复制动物模型是研究病毒特性和评价抗HBV药物效果的重要工具,本研究目的是建立中国流行的C基因型野生型及多重耐药型HBV稳定复制小鼠模型并应用于NAs评价。方法:(1)分别构建携带1.3拷贝C基因野生(WT)和MDR HBV基因组(adr血清型)的重组腺相关病毒质粒p AAV2neo-1.3HBV-C-WT和p AAV2neo-1.3HBV-C-MDR。酶切和测序鉴定正确后分别体外转染人肝癌细胞Huh7,用实时荧光定量PCR法检测上清病毒水平,用ELISA方法检测抗原水平。确认无误后将病毒进行包装纯化。(2)将高滴度r AAV8-1.3HBV-C-WT病毒经尾静脉注射入6-8周龄C57BL/6小鼠体内,建立野生HBV稳定复制小鼠模型26只。小鼠体内病毒稳定复制表达5周后,随机抽取两只小鼠取肝组织进行HE染色和免疫组化分析。将剩余小鼠随机分成4组(n=6)不同给药组,分别为恩替卡韦组(ETV,0.1mg/kg)、替诺福韦酯组(TDF,62mg/kg)、ETV(0.1mg/kg)+TDF(62mg/kg)组和生理盐水(NS)对照组,连续给药2周之后停药观察5周。动态监测其血清(眼底静脉丛采血)HBV DNA载量和HBs Ag、HBe Ag的抗原表达量。(3)用上述方法建立多重耐药型HBV稳定复制小鼠模型30只,同时以野生小鼠模型30只作为对照组,小鼠体内病毒稳定复制表达6周后,将野生组和多重耐药组两组模型小鼠随机分成5组(n=6)不同给药组,分别为ETV组(0.1mg/kg)、TDF组(62mg/kg)、ETV(0.1mg/kg)+阿德福韦酯组(ADV,2.1mg/kg)、ETV(0.1mg/kg)+TDF(62mg/kg)组和NS对照组,给药2周后停药监测8周。动态监测其血清(眼底静脉丛采血)HBV DNA载量和HBs Ag、HBe Ag的抗原表达量。结果:(1)重组质粒p AAV2neo-1.3HBV-C-WT和p AAV2neo-1.3HBV-C-MDR转染Hu H7细胞72h后上清中HBV DNA载量均值分别为8.71 lg IU/ml和8.74 lg IU/ml;HBs Ag OD(A450nm)均值分别为3.50和3.38;HBe Ag OD(A450nm)均值分别为3.41和3.33。表明重组质粒构建正确并可在Huh7细胞中高水平复制和表达。(2)小鼠尾静脉注射r AAV8-1.3HBV-C-WT后,建模观察5周,HBV DNA定量维持在3.90~4.54 lg IU/ml,HBs Ag和HBe Ag OD(A450nm)维持在2以上,提示建模成功。给药1周后检测结果显示,三个给药组(ETV组、TDF组、ETV+TDF组)HBV DNA定量分别下降了1.84、2.23和2.08 lg IU/ml,与给药前一周相比HBV DNA下降具有统计学意义(P0.05);NS组小鼠HBV DNA定量与给药前持平。各给药组在停药1~2周后HBV DNA复制均出现反弹(1.0 lg IU/ml)。HBV-WT复制小鼠模型在造模、用药以及停药观察期间,抗原检测OD(A450nm)均有大于2的高表达。(3)HBV-C-MDR复制小鼠模型观察6周过程中血清HBV DNA稳定复制为3.14~5.49 lg IU/ml,HBs Ag OD(A450nm)维持在1.21~4.00,HBe Ag维持在1.67~4.00;NAs药物用药2周后,各用药组(ETV、TDF、ETV+ADV、ETV+TDF)HBV DNA定量下降0.91,0.90,0.88,0.93 lg IU/ml(P0.05),但预想不到的是NS组HBV DNA也检测到2.00 lg IU/ml的明显下降(P0.05)。停药后观察8周,各组病毒复制均有波动。阳性对照HBV-C-WT复制小鼠模型组,造模观察6周过程中血清HBV DNA定量稳定为3.65~6.05 lg IU/ml;NAs药物用药2周后,各用药组(ETV、TDF、ETV+ADV、ETV+TDF)HBV DNA定量下降3.66、3.48、3.18、2.89 lg IU/ml(P0.05),NS组无明显下降(P0.05);各给药组在停药1~2周后HBV DNA复制均出现反弹(2 lg IU/ml)。HBV-C-WT复制小鼠模型在造模、用药以及停药观察期间,抗原检测均大于2的高表达。结论:本研究成功构建了p AAV2neo-1.3HBV-C-WT和p AAV2neo-1.3HBV-C-MDR重组质粒。并成功建立了重组腺相关病毒介导的C基因野生型HBV稳定复制表达小鼠模型,初步验证了NAs在上述模型小鼠体内可有效抑制野生病毒复制。本实验亦对多重耐药HBV复制小鼠模型的建立进行了探索,但与预期目标尚有一定差距,尚待进一步研究完善。以上小鼠模型的建立为进一步筛选新型有效抗中国流行株C基因型HBV药物和治疗方法提供了研究工具。
[Abstract]:Objective : Hepatitis B virus ( HBV ) infection is a worldwide public health threat . HBV infection can lead to liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma . HBV - C - WT and pAAV2neo - 1.3HBV - C - MDR are detected . Results : ( 1 ) The mean values of HBV DNA were 3.41 and 3.38 , respectively , and the mean values of HBV DNA were 3.41 g IU / ml and 8.74 lg IU / ml , respectively . The results showed that : ( 1 ) The HBV DNA content of the recombinant plasmid pAAV2neo - 1.3HBV - C - WT and pAAV2neo - 1.3HBV - C - MDR decreased by 1 . 84 , 2 . 23 and 2 . 08 lg IU / ml , respectively . ( 3 ) HBV - C - WT replication in mice was 3.14 - 5.49 lg IU / ml , HBsAg OD ( A450 nm ) decreased by 3.65 - 6.05 lg IU / ml ( P0.05 ) . After two weeks of drug administration , the HBV DNA of each group ( ETV , TDF , ETV + ADV, ETV + TDF ) decreased 3.66 , 3.48 , 3.18 , 2.89 lg IU / ml ( P0.05 ) . Conclusion : This study successfully constructed the recombinant plasmid pAAV2neo - 1.3HBV - C - WT and pAAV2neo - 1.3HBV - C - MDR .

【学位授予单位】：桂林医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R512.62;R-332

【参考文献】