三种海水鱼类种质冷冻保存及相关基因的表达分析

发布时间：2018-05-05 23:51

  本文选题：精子 + 胚胎　； 参考：《上海海洋大学》2016年硕士论文

【摘要】：目前,由于生态环境变化、人工捕捞过度等因素,导致鱼类种质资源数量降低,所以对鱼类精子和胚胎进行冷冻保存技术的研究,对鱼类种质资源保存具有重要意义。目前在鱼类胚胎冷冻研究成功的主要指标是成活率的高低,由于成活率较低,鱼类胚胎冷冻保存在生产养殖上并没有得到广泛应用,所以对其进行相关的分子机理研究是非常必要的。本文利用鱼类精子及胚胎冷冻保存技术分别对钝吻黄盖鲽(Pseudopleuronectes yokohamae)和海水青溕(Oryzias melastigma)进行了研究,并对0℃低温状态下牙鲆(Paralichthys olivaceus)胚胎的内参基因进行了筛选及三个相关的基因CIRP、SOX9和HSP70在低温处理的牙鲆胚胎中的表达进行了研究。本研究首先以性成熟的雄性钝吻黄盖鲽为实验材料,对精子稀释液种类及成分、抗冻剂种类、激活精子海水盐度和冷冻精液授精实验等进行筛选。结果表明,利用MFs-3稀释液分别与20%1,2-PG和20%EG抗冻剂作为精子抗冻保存液时,冷冻效果最好,其精子活力分别达到最高。将PG组和EG组冷冻保存的精子解冻后分别与其卵子进行授精实验,PG组受精率和孵化率为(80.08±0.68)%和(77.44±1.76)%,EG组则为(80.17±0.45)%和(77.92±1.33)%,与鲜精相比无显著性差异。利用计算机辅助精子分析系统CASA测定MFs-3+20%PG和MFs-3+20%EG冷冻保存的钝吻黄盖鲽精子的各项运动参数,结果显示,二者的VCL、VSL、BCF、LIN和STR的数值差异性不显著。本研究利用MFs-3+20%PG和MFs-3+20%EG成功冷冻了钝吻黄盖鲽的精子,为钝吻黄盖鲽精子冷冻保存技术、人工杂交育种繁殖及种质资源库的建立奠定了基础。为了更好的研究海水鱼类的胚胎冷冻保存,本实验采用海水青溕进行研究,因为青溕属于模式生物而且产卵量不随季节的变化而变化,只要控制水温恒定、提供合理的营养及光周期,产卵量就不会受到影响。本文首先对海水青溕的胚胎发育进行了观察,并选取了几个胚胎关键时期,分别为原肠期、神经胚期、22-28肌节期、尾芽期、心跳期及胚体转动期。对不同玻璃化液中抗冻剂的种类和浓度进行了筛选,目的是筛选出冷冻海水青溕的最优玻璃化配方。结果显示,利用50%PM的玻璃化液处理六个时期的胚胎时,胚体转动期的孵化率高达(48.33±10.41)%。利用PG、MeOH和Gly三种渗透性抗冻剂按PM(PG:MeOH=3:2):Gly=1:1,2:1,3:1,4:1的比例进行配置玻璃化液,发现比例为2:1,即PMG2玻璃化液时所处理的胚胎的孵化率最高。对不同糖类的种类及浓度进行筛选时,发现葡萄糖对胚体转动期的毒性最低,并且当葡萄糖浓度为4%时胚胎的孵化率为最高,为(48.67±1.15)%。利用最终筛选出的玻璃化液PMG2G4超低温冷冻保存胚体转动期胚胎共309枚,解冻后保持完整胚胎的有122枚。本文从分子水平上对牙鲆胚胎在低温状态下的基因表达进行了研究,为鱼类胚胎冷冻分子机理奠定了基础。首先利用0℃及16.5℃温度分别处理牙鲆肌节期、尾芽期和心跳期胚胎,利用GeNorm和NorFinder两个分析内参基因的软件对18S rRNA、ACTB、GAPDH及EF1α四个内参基因的稳定性进行分析。结果显示,利用GeNorm软件分析时四个内参基因的稳定性排序为18S rRNA=EF1αACTBGAPDH;利用NorFinder软件进行分析时,内参基因稳定性大小排序为18S rRNAACTBEF1αGAPDH。通过GeNorm和NorFinder两个软件的综合分析,认为18S rRNA在低温处理牙鲆胚胎后稳定性最强,要优于其他三个内参基因。为研究低温对牙鲆胚胎基因表达的影响,选取对温度适应强的尾芽期胚胎进行0℃低温处理,对在16.5℃正常温度发育下的胚胎作为对照组。选取在胚胎时期有表达的三个基因CIRP、S0X9和HSP70,然后利用q RT-PCR的方法对基因在胚胎中的表达量进行分析。结果发现,CIRP在0℃处理0~30min内表达量降低,之后有所升高,并在120min时CIRP的表达量升到最大值,但在处理180min时,表达量下降,与对照组没有显著性差异。S0X9同样在处理30min内表达量降低,与CIRP的不同是在120~180min表达量下降并显著低于对照组水平。而HSP70在低温处理的整个过程中都表现出表达水平升高的现象,与对照组有显著性差异。本文通过研究发现低温的确会改变CIRP、S0X9和HSP70表达水平。
[Abstract]:The results showed that the results showed that the results showed that the results showed that the sperm viability of fish embryos was higher than that of fresh sperm . The results showed that the results showed that the results showed that the sperm viability of fish embryos was higher than that of fresh sperm .

【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S917.4

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本文编号：1849803