S100A8基因在HL-60细胞中的生物学作用及耐药机制研究

发布时间：2018-05-06 04:16

本文选题：S100A8 + 慢病毒载体　；参考：《苏州大学》2016年博士论文

【摘要】：越来越多的研究表明慢性炎症会增加恶性肿瘤的发生风险(即:炎症诱发肿瘤),近年来炎症因子参与肿瘤发生发展的机制研究成为新的热点。作为炎性因子家族蛋白的成员之一,S100蛋白家族成员与恶性肿瘤的发生密切相关。近年来发现S100A8与胃癌、结肠癌、胰腺癌、膀胱癌、卵巢癌、甲状腺癌、乳腺癌和皮肤癌等关系密切,提示其肿瘤性作用。本课题组前期的研究发现,在成人初发急性髓细胞性白血病(Acute myeloid leukemia,AML)病人中,S100A8基因在转录水平高表达的患者生存期短。在儿童AML,S100A8的表达水平具有评估早期治疗反应的作用。本试验拟通过构建S100A8慢病毒表达载体转染急性髓细胞性白血病细胞株HL-60,研究S100A8对HL-60细胞生物学特性的影响和药物反应,探讨S100A8在HL-60细胞中的作用机制。第一部分构建S100A8慢病毒载体及慢病毒的包装目的:构建S100A8慢病毒载体并包装慢病毒颗粒,为该基因在AML的生物学作用及对化疗药物耐药作用中的研究奠定基础。方法:以正常人BMMC cDNA为模板,克隆出S100A8全长cDNA并装载入pMD19-T载体中后进行测序鉴定。将测序正确的阳性克隆中的S100A8片段装载入目的载体pLVX-IRES-puro中,筛选阳性克隆后进行双酶切、PCR及测序鉴定。利用磷酸钙沉淀法,将过表达载体与病毒包装质粒共同转染293T细胞,分别收集病毒上清。结果:成功克隆出的S100A8片段,并构建到了p LVX-IRES-puro中,称为pLVX-S100A8。将过表达载体与病毒包装质粒共同转染293T细胞,包装慢病毒颗粒。结论:成功构建S100A8慢病毒载体,并且包装出慢病毒颗粒。第二部分 S100A8基因在HL-60细胞中稳定表达及其生物学功能研究目的:S100A8在AML细胞株HL-60稳定表达后,观察S100A8对HL-60细胞增殖、凋亡、细胞周期、迁移及侵袭的影响。方法:1.实验分组:空载体对照组(p LVX-control)以及高表达S100A8实验组(p LVX-S100A8);2.收集实验组和对照组细胞,分别制备成c DNA及蛋白,采用实时荧光定量RT-PCR和Western Blot分析S100A8在转染细胞中的m RNA和蛋白表达水平;3.CCK-8方法测定细胞活力,绘制生长曲线,观察S100A8对HL-60细胞增殖的影响;4.利用FCM检测S100A8对HL-60细胞周期和凋亡的影响;5.利用Transwell小室观察两组细胞的迁移和侵袭能力。结果:1.q RT-PCR和Western Blot检测两组细胞结果显示,S100A8在转染了p LVX-S100A8细胞中的表达显著强于其在对照细胞中的表达量;2.实验组与对照组相比,高表达S100A8对HL-60细胞的增殖、凋亡无明显差异(P0.05);3.体外跨膜实验结果显示,高表达S100A8实验组(p LVX-S100A8)细胞株的侵袭能力比对照组明显增加(0.701±0.058 Vs 0.289±0.032,p0.0001);而迁移能力两组之间无显著差异(P0.05)。结论:外源性上调S100A8促进HL-60体外侵袭能力,但对于细胞的增殖、凋亡及迁移无影响。第三部分过表达S100A8基因促进HL-60细胞对足叶乙甙耐药的机制探讨目的:研究S100A8过表达的AML细胞株HL-60对临床常规化疗药物(足叶乙甙、阿霉素、阿糖胞苷以及高三尖杉酯碱)的耐药性,并对其机制进行初步探讨。方法:1.用足叶乙甙、阿霉素、阿糖胞苷、高三尖杉酯碱作用HL-60细胞,CCK-8法检测细胞抑制率,观察S100A8基因对药物敏感性的影响;2.用300ng/ml浓度的足叶乙甙(VP-16)处理实验组和空载组细胞72h,取两组细胞行FCM,分析细胞周期和凋亡的变化;3.收集300ng/ml足叶乙甙浓度处理的两组细胞,制备成c DNA,用PCR Aarry的方法分析两组细胞的差异表达基因;4.用Western Blot验证Bcl-2、Caspasce-3和Bax基因在两组细胞中蛋白表达水平变化情况。结果:1.药物实验显示,高表达S100A8增加了HL-60细胞对VP-16耐药性(p0.0001);而对阿霉素、阿糖胞苷、高三尖杉酯碱的敏感性无明显影响(P0.05);2.VP-16处理两组细胞后,p LVX-S100A8组的凋亡比率显著低于p LVX-control组细胞(p0.05),而两组细胞的周期比例没有统计学差异(P0.05);3.凋亡PCR Array实验结果显示,S100A8高表达组和空载组比较有48个差异表达基因,发现被上调的有12基因,下调的有36个基因;4.Western Blot结果显示Caspasce-3和Bax的表达被下调,而Bcl-2的表达没有变化。结论:S100A8的高表达可以引起AML细胞株HL-60对临床常规化疗药物足叶乙甙的显著耐药,其机制可能是通过下调线粒体凋亡途径实现的。
[Abstract]:In this study , it was found that in the patients with acute myeloid leukemia ( AML ) , the expression level of S100 protein was shorter than that of cancer , colon cancer , pancreatic cancer , bladder cancer , ovarian cancer , thyroid cancer , breast cancer and skin cancer . The results showed that the proliferation of HL - 60 cells was significantly higher than that in the control group ( P < 0.05 ) . Results : 1 . The expression of Bcl - 2 , Caspasce - 3 and Bax was significantly lower than that of p - LVX - control group ( P < 0.05 ) .

【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R730.2;R364.5

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